引用本文
蔡丽萍, 刘雅琴, 孟然, 张宏. 普拉洛芬在干眼中对Th1细胞趋化因子受体CXCR3和CCR5表达的影响[J]. 中华眼视光学与视觉科学杂志, 2017,19(6): 364-368.
Liping Cai, Yaqin Liu, Ran Meng, Hong Zhang. Effect of Pranoprofen on the Expression of Chemokine Receptors CXCR3 and CCR5 of Th1 Cells in Dry Eye Patients[J]. CHINESE jOURNAL OF OPTOMETRY OPHTHALMOLOGY AND VISUAL SCIENCE, 2017,19(6): 364-368.  
Doi:10.3760/cma.j.issn.1674-845X.2017.06.009
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普拉洛芬在干眼中对Th1细胞趋化因子受体CXCR3和CCR5表达的影响
蔡丽萍, 刘雅琴, 孟然, 张宏
通信作者：张宏,Email：nature2735@163.com
收稿日期: 2017-03-06
基金资助: 乌鲁木齐市科学技术计划项目（Y131310003）
摘要

目的 观察普拉洛芬对Th1细胞CXC趋化因子受体3（CXCR3）和CC趋化因子受体5（CCR5）表达的影响,并探讨其抑制干眼炎症免疫反应的机制。方法 随机对照试验。纳入干眼患者170例（170眼）,均选取右眼为观察眼。采用随机数字表法分为试验组和对照组,各85例（85眼）。试验组予普拉洛芬联合玻璃酸钠点眼,均每日4次,每次1滴;对照组仅玻璃酸钠点眼,每日4次,每次1滴。于治疗前和治疗后30 d时进行随访,检测并比较2组泪液分泌量（SIt）、泪膜破裂时间（BUT）、角膜荧光素染色（CFS）评分,CXCR3和CCR5表达率,及两者与BUT和CFS关系。采用Pearson直线相关分析以及t检验对数据进行分析。结果 治疗后2组BUT均较治疗前延长（t=-13.27、-13.53,均P<0.05）,且试验组长于对照组（t=10.11,P<0.05）;治疗后2组CFS评分均低于治疗前（t=7.34、5.27,均P<0.05）,且试验组低于对照组（t=5.15,P<0.05）;治疗后试验组CXCR3、CCR5的表达率低于治疗前（t=6.74、9.27,均P<0.05）,且试验组低于对照组（t=3.29、2.83,均P<0.05）;试验组CXCR3、CCR5表达率与BUT呈负相关（r=-0.22、-0.22,均P<0.05）,与CFS评分呈正相关（r=0.28、0.23,均P<0.05）。结论 普拉洛芬可通过下调眼表Th1细胞CXCR3和CCR5的表达来发挥对干眼的治疗作用。

关键词: 干眼; 普拉洛芬; CXC型趋化因子受体3; CC型趋化因子受体5; 趋化因子
Effect of Pranoprofen on the Expression of Chemokine Receptors CXCR3 and CCR5 of Th1 Cells in Dry Eye Patients
Liping Cai1,2, Yaqin Liu1, Ran Meng1, Hong Zhang1
1Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China
2Department of Ophthalmology, the First People′s Hospital of Tianshui, Tianshui 741000, China
Corresponding author: Hong Zhang, Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China (Email: nature2735@163.com)
Fund:This study was funded by Research Foundation of Urumqi Science and Technology Bureau (Y131310003)
Abstract

Objective: To investigate the effect of pranoprofen on the expression of CXC chemokine receptor 3 (CXCR3) and CC chemokine receptor 5 (CCR5) of Th1 cells in dry eye patients, and to explore the correlation of changes in receptor expression with clinical changes of dry eye signs.Methods: This study included 170 patients with dry eye in a randomized, controlled clinical trial. The right eyes of the patients ( n=85) administered 0.1% pranoprofen and 0.1% sodium hyaluronate drops (4 times/day). The right eyes of the control dry eye patients ( n=85) received 0.1% sodium hyaluronate drops alone (4 times/day). The two groups were followed up before administration and 30 days later. The primary clinical indexes that were evaluated included Schirmer I test (SIt), tear film break-up time (BUT), and corneal fluorescein staining (CFS). Differences in the expression of CXCR3 and CCR5 were compared between the two groups. Changes in the expression levels of CXCR3 and CCR5 were correlated with changes in SIt, BUT, and FIS. The data were analyzed by t test and pearson correlation.Results: The tear BUT was significantly longer in both groups after treatment compared to the pretreatment values ( t=-13.27, -13.53, both P<0.05). Additionally, the tear BUT was significantly longer in the pranoprofen-treated test group compared to the control group ( t=10.11, P<0.05). The CFS scores in both groups were lower than before treatment ( t=7.34, 5.27, both P<0.05), and it was significantly lower in the test group compared with the control group ( t=5.15, P<0.05). Expression levels of both CXCR3 and CCR5 were significantly reduced in the test group than pretreatment ( t=6.74, 9.27, both P<0.05), and it was significantly lower in the test group, compared with the pretreatment values ( t=3.29, 2.83, both P<0.05). The expression levels of both CXCR3 and CCR5 were negatively correlated with BUT ( r=-0.22, -0.22, both P<0.05) and positively correlated with CFS ( r=0.28, 0.23, both P<0.05).Conclusion: Pranoprofen inhibits the inflammatory immune response in dry eye by down-regulating the expression of the chemokine receptors CXCR3 and CCR5 on Th1 cells.

Keyword: dry eye; pranoprofen; CXC chemokine receptor 3; CC chemokine receptor 5; chemokine

干眼是最为常见的眼表疾病, 目前认为干眼是眼局部的自身免疫性疾病, 基于固有免疫和适应性免疫的炎症反应是引起干眼病理损害的重要机制[1, 2], 其中趋化因子超家族及其受体在干眼免疫应答中充当重要的“ 导航” , 募集大量炎性细胞迁移到眼表组织并发生浸润。前期研究发现, 干眼患者眼表Th1细胞浸润、募集及活化伴随着CXC型趋化因子受体3（CXC chemokine receptor 3, CXCR3）、CC型趋化因子受体5（CC chemokine receptor 5, CCR5）及其配体的上调, 从而推测CXCR3、CCR5及其配体可作为调节干眼炎症免疫反应的靶点[3]。同时, 在普拉洛芬联合玻璃酸钠滴眼液治疗干眼的临床试验中发现, 联合用药较单独使用玻璃酸钠滴眼液能更有效改善干眼症状及体征[4]。尽管普拉洛芬抑制炎症的作用在干眼多中心随机对照临床试验中已被证实[5, 6], 但其抑制炎症免疫反应的分子机制仍在探索中。Fiorelli等[7]认为普拉洛芬滴眼液是通过抑制环氧化酶, 阻止花生四烯酸分解成前列腺素, 从而发挥抑制眼部炎症的作用。而普拉洛芬滴眼液对干眼患者眼表趋化因子表达影响的研究目前鲜见报道。本研究将通过观察普拉洛芬滴眼液对眼表Th1细胞CXCR3和CCR5表达的影响, 进一步探讨普治拉洛芬抑制干眼炎症免疫反应的机制。

1 对象与方法
1.1 对象

选择2014年7月至2015年6月在新疆医科大学第一附属医院眼科门诊确诊的干眼患者。对于纳入研究的干眼患者, 均取右眼为观察眼。纳入标准：①有典型的干眼症状者; ②符合下列检查中2项以上者：泪液分泌试验 I（Schirmer I test, SIt）< 10 mm/5 min; 泪膜破裂时间（Break up time, BUT）< 10 s; 角膜荧光素染色（Coreal fluorescence stain, CFS）异常。排除标准：①近3个月内有眼部活动性病变者; ②3个月内配戴角膜接触镜者; ③6个月内施行眼部手术者; ④被选对象拒绝合作且不能完成随访者; ⑤干燥综合征患者。本研究获得新疆医科大学第一附属医院伦理委员会批准（审批号：20151126-08）, 所有患者均签署知情同意书。

1.2 主要试剂及仪器

0.1%玻璃酸钠滴眼液、0.1%普拉洛芬滴眼液（日本千寿制药株式会社）; 乙酸纤维素薄膜（浙江路桥四青生化材料厂）; 泪液检测滤纸条、荧光素钠试纸（天津晶明新技术开发有限公司）; APC anti-Human CXCR3、PE anti-Human CCR5（美国Biolegend公司）; 1640培养液（美国invitrogen公司）; FACS Calibur型流式细胞仪（美国ABI公司）。

1.3 方法

1.3.1 随机方法 采用随机数字表法, 将干眼患者分为2组, 观察组使用0.1%普拉洛芬滴眼液联合0.1%玻璃酸钠滴眼液点眼, 每日4次, 每次1滴, 2种药使用间隔时间至少10 min。对照组仅使用0.1%玻璃酸钠滴眼液点眼, 每日4次, 每次1滴。均选取右眼为观察眼。分别于治疗前和治疗后30 d时进行随访。

1.3.2 临床检查 受检者均行SIt、BUT及CFS检查。SIt：将泪液试纸条放至患者下眼睑中外1/3处结膜囊内, 嘱患者轻轻下看闭眼, 泪液试纸条湿长< 10 mm/5 min为阳性。BUT：将荧光素钠试纸用0.9%氯化钠溶液浸湿, 使荧光素钠滴入结膜囊内, 嘱患者瞬目数次, 计算最后一次瞬目后第1个黑斑出现的时间, < 10 s为异常, 测量2次, 取其平均值。CFS评分采用12分法：将角膜分为4个象限, 每个象限为0~3分, 无染色为0分, 1~30个点状着色为1分, > 30个点状着色但染色未融合为2分, 3分为出现角膜点状着色融合、丝状物及溃疡等。

1.3.3 结膜上皮细胞采集 将5 mm× 7 mm大小的乙酸纤维素薄膜消毒并干燥后, 用眼科无齿镊夹住乙酸纤维素薄膜一角分别轻轻置于颞侧、上方及鼻侧球结膜表面轻压5 s后取出, 立即浸入装有1 ml 1640的培养液中。6 h内对乙酸纤维素膜行如下处理：经PBS缓冲液冲洗、振荡, 取出乙酸纤维素膜后, 进行细胞计数, 并调整细胞浓度为1× 105/ml, 即刻进行流式细胞术检测。

1.3.4 CXCR3和CCR5阳性表达率检测 收集结膜上皮细胞, 洗涤（1β 500 rpm, 5 min）2遍, 用PBS将细胞重悬为107个/ml, 各取100 μ l的体系重悬后的细胞分别放入2个1.5 ml EP管中, 分别在2个EP管中加入荧光素（Phycoerythrin, PE）标记的CXCR3及CCR5抗体, 避光孵育30 min后, 加入200 μ l PBS, 上机进行流式细胞仪检测。

1.4 统计学方法

随机对照试验。采用GraphPad prism 5.0统计学软件进行数据分析。各测试指标的数据资料均以± s表示。采用完全随机分组两水平实验设计, 2组组间SIt、BUT及CFS评分的差异比较均采用独立样本t检验; 同组治疗前后的临床指标和表达率比较采用自身对照设计, 应用配对t检验, 均采用双侧检验。CXCR3和CCR5阳性率与各项干眼相关指标的关系分析采用Pearson直线相关分析, 双尾检验法。以P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组患者治疗前一般情况分析

共纳入患者170例（170眼）, 对照组85眼, 观察组85眼。观察组中男11例, 女74例, 年龄20~58岁, 平均（47.4± 11.1）岁; 对照组中男13例, 女72例, 年龄21~60岁, 平均（50.1± 12.2）岁。2组研究对象年龄及性别构成比差异无统计学意义（均P> 0.05）。2组患者治疗前干眼临床资料比较差异均无统计学意义（均P> 0.05）。

2.2 2组治疗前后干眼临床指标检查结果的比较

治疗后对照组和观察组SIt均高于治疗前, 但差异无统计学意义（t=0.19、0.25, 均P> 0.05）, 治疗后观察组SIt高于对照组, 但差异无统计学意义（t=1.34, P> 0.05）; 治疗后观察组和对照组BUT均较治疗前明显延长（t=-13.27、-13.53, 均P< 0.05）, 且治疗后的观察组BUT明显长于对照组（t=10.11, P< 0.05）; 治疗后观察组和对照组CFS评分均明显低于治疗前（t=7.34、5.27, 均P< 0.05）, 且治疗后观察组CFS评分明显低于对照组（t=5.15, P< 0.05）, 见表1。

2.3 2组治疗前后结膜上皮细胞CXCR3和CCR5的阳性表达率

治疗后对照组CXCR3和CCR5的阳性表达率均较治疗前低, 但差异无统计学意义（均P> 0.05）。治疗后观察组CXCR3和CCR5的阳性表达率均明显低于治疗前, 差异有统计学意义（t=6.74、9.27, 均P< 0.05）, 且治疗后观察组CXCR3和CCR5的阳性表达率明显低于对照组, 差异有统计学意义（t=3.29、2.83, 均P< 0.05）。见表2和图1。

表1 试验组和对照组治疗前后临床指标对比 Table 1 Clinical indicators of test and control groups before and after treatment
表2 结膜上皮细胞CXCR3和CCR5的阳性表达率对比 Table 2 Expression of CXCR3 and CCR5 in conjunctival epithelial cells

图1. 对照组和试验组治疗前后结膜上皮细胞CXCR3、CCR5 流式分析图Figure 1. Flow analysis diagram of CXCR3 and CCR5 in control and test groups conjunctival epithelial cells before and after treatment.
CXCR3, CXC chemokine receptor 3; CCR5, CC chemokine receptor 5.

2.4 CXCR3和CCR5阳性表达率与BUT和CFS的相关性

治疗后观察组CXCR3和CCR5的阳性表达率分别与BUT呈负相关（r=-0.22、-0.22, 均P< 0.05）与CFS评分呈正相关（r=0.28、0.23, 均P< 0.05）。

3 讨论

近年来干眼的炎症免疫机制及相应的抗炎治疗一直是眼科研究的热点。大量证据显示干眼是基于固有免疫和适应性免疫的眼局部自身免疫性疾病, 其中CD4+T细胞在炎症免疫反应中起着重要作用[2, 8], 而趋化因子超家族及其受体在此过程中决定着淋巴细胞向靶器官或组织的迁徙。朱俊雕等[9]和Yoon等[10]发现干眼患者眼表Th1相关趋化因子受体及其配体表达增加。Coursey等[11]实验发现, CXCR3敲除和CCR6敲除小鼠暴露于干燥环境中不形成干眼, 且没有Th1细胞在眼表组织的迁移。Karin等[12]提出趋化因子CXCR3信号通道能够调控效应性。CD4+T细胞向不同T细胞亚群分化, 继而产生不同的免疫效应。以上研究均表明趋化因子的表达是导致干眼自身免疫性疾病发生发展的一个重要因素。

干眼早期细胞因子通过激活自然杀伤细胞（Natural killer cell, NK）后产生干扰素-γ , 干扰素-γ 诱导Th1相关趋化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11在眼表的表达增加[13], NK细胞、活化的Th1细胞、巨噬细胞、树突状细胞等免疫细胞通过其表面趋化因子受体CXCR3感知其配体CXCL9、CXCL10、CXCL11浓度梯度的变化, 定向游动或沿血管内皮爬行浸润到眼表组织, 并通过级联反应, 诱导树突状细胞和巨噬细胞产生更多的趋化因子, 吸引更多的免疫细胞进入眼表组织, 由此启动了适应性免疫应答。而趋化因子要发挥其生物学效应, 必须通过与靶细胞表面趋化因子受体相结合才能实现。两者结合后, 激发特定的信号转导通路, 引起受体分子构象发生变化, 导致与受体偶联的G蛋白活化, Gα 亚基与β γ 二聚体解离, 激活一系列效应酶, 启动下游PTK-Ras-MAPK、JAK-STAT、cAMP-PKA等信号转导通路, 从而影响靶基因相应转录因子的表达, 进而调控细胞不同的生理、生化功能。

本研究发现, 普拉洛芬滴眼液与玻璃酸钠滴眼液联合应用后, 更能有效减轻眼表炎症、延长BUT、降低CXCR3和CCR5的阳性表达率, 且CXCR3及CCR5的阳性表达率分别与BUT呈负相关、与CFS评分呈正相关, 而泪液分泌功能无明显改善。

以往研究表明非甾体类抗炎药物可通过抑制环氧合酶通路, 抑制眼部炎症[5, 7]。而本研究的实验结果显示, 普拉洛芬滴眼液可通过改变CXCR3和CCR5受体的表达减轻眼表炎症反应。从前期对趋化因子在干眼致病机制中的深入研究, 笔者推测随着趋化因子受体表达谱的改变, 可能使得其表面表达这种趋化因子受体的免疫细胞（如NK细胞、活化的Th1细胞、巨噬细胞、树突状细胞等）向炎症部位的迁移减少。另外, 随着减少的趋化因子受体与其配体的分离, 细胞内传入信号中断, 继而关闭由G蛋白介导的多条信号转导通路, 从而使眼表炎症免疫反应得到抑制, 改善病情。这为普拉洛芬抑制干眼炎症免疫机制提供了新的理论依据。本研究不足之处在于未能对趋化因子CXCR3的配体CXCL9、CXCL10、CXCL11进行监测。同一受体CXCR3与其不同的配体结合, 激活不同的信号通路, 产生不同的生物学效应[14], CXCL11和其他配体相比, 与CXCR3具有更高的亲和力, 并能高选择性地作用于CXCR3[12]。CXCL11能否成为介导、限制炎症免疫反应的另一靶点, 尚需在后期的研究中进一步证实。

利益冲突申明 本研究无任何利益冲突

作者贡献声明 蔡丽萍：收集数据, 参与选题、设计及资料的分析和解释; 撰写论文; 对编辑部的修改意见进行修改。刘雅琴：参与选题、收集资料、数据分析和修改论文的结果、结论。孟然：参与选题、收集资料、数据分析。张宏：参与选题、设计、资料的分析和解释, 修改论文中关键性结果、结论, 对编辑部的修改意见进行核修

The authors have declared that no competing interests exist.

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