第一作者:景常莹(ORCID:0000-0002-0671-4114),Email:15692317603@163.com
目的探讨白芍总苷(TGP)对实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)大鼠肝脏中自然杀伤T(NKT)细胞基因表达的影响。方法实验研究。45只Lewis大鼠采用随机数字表法分为正常对照组、EAU模型组和TGP干预组,每组15只。EAU模型组和TGP干预组注射含光感受器间维生素A结合蛋白(IRBP 1177-1191)的乳糜液以诱导出葡萄膜炎,正常对照组注射等体积的不含IRBP多肽的乳糜液。于免疫后每天对TGP干预组大鼠进行TGP灌胃给药,其余2组给予0.9%氯化钠溶液灌胃,并每天采用裂隙灯显微镜观察各组大鼠眼前节炎症反应,记录发病程度,并进行炎症评分。免疫后第12天分别提取3组大鼠的眼球制成病理切片,观察炎症反应。收集3组大鼠肝脏CD4+ T细胞,流式细胞仪检测NKT细胞的表达水平,观察变化趋势;采用RT-PCR和ELISA分别检测白细胞介素-4(IL-4)、干扰素-γ(IFN-γ)mRNA和蛋白表达情况。采用单因素方差分析进行数据处理。结果免疫后第12天,TGP干预组炎症评分和病理分级明显低于EAU模型组,但是高于正常对照组;与正常对照组相比,EAU模型组和TGP干预组NKT表达水平明显较高,且TGP干预组高于EAU模型组( P<0.05);TGP干预组大鼠肝脏中IFN-γ的mRNA表达显著低于EAU模型组( P<0.001);TGP干预组大鼠肝脏中IL-4 mRNA低于正常对照组( P<0.001),但明显高于EAU模型组( P<0.001);TGP干预组大鼠肝脏IFN-γ蛋白浓度高于正常对照组( P<0.001),低于EAU模型组( P=0.01);TGP干预组大鼠肝脏中IL-4蛋白表达高于EAU模型组( P<0.001)。结论TGP可通过调节EAU大鼠IL-4、IFN-γ基因的表达水平,增加EAU大鼠中NKT细胞的表达数量,达到治疗葡萄膜炎的目的。
Objective:To investigate the effects of total glucosides of paeony (TGP) on natural killer T (NKT) cell gene expression in liver of experimental autoimmune uveitis (EAU) rats.Methods:Experimental study. Forty-five Lewis rats were randomly divided into three groups: normal controls, EAU-stimulated rats (model group), and EAU-stimulated rats treated with TGP (TGP intervention group). Control animals received an emulsion of phosphate-buffered saline (PBS) and CFA, which was injected subcutaneously. The other two groups were injected an equal volume of chylomicron containing interphotoreceptor retinoid-binding protein polypeptide (IRBP). Inflammation was observed by daily slit-lamp microscopy of the anterior segments after immunization. The incidence of inflammation and the inflammation scores were recorded. At 12 days after immunization, we extracted the eyes for pathologic examination, and CD4+ T cells were collected from the livers. The expression levels of NKT cells were detected by flow cytometry. Reverse transcription polymerase change reaction (RT-PCR) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) were used to measure the gene and protein expression levels of interleukin (IL)-4 and interferon (IFN)-γ. Data were analyzed by one-way ANOVA.Results:Twelve days after immunization, the inflammatory score and pathological grade of the TGP group were significantly lower than in the EAU group, but higher than in the normal group. Flow cytometry showed that compared with normal control group, the number of liver NKT cells in the EAU group and in the TGP intervention group were significantly increased. Further, the increased in the number of NKT expression in the TGP intervention group was higher than in the EAU group ( P<0.05) during the inflammatory phase. RT-PCR showed that on day 12 the expression of IFN-γ mRNA in the liver of the TGP intervention group was significantly higher than in the control group ( P<0.001), but lower than in the EAU group ( P<0.001). At the same time, the expression of liver IL-4 mRNA in the TGP group was lower than that of the normal group ( P<0.001), but significantly higher than the EAU group ( P<0.001). ELISA showed that the liver IFN-γ levels in the TGP group were significantly lower in the EAU group after 12 days ( P=0.01). The concentration of liver IL-4 protein was higher in the TGP group than in the EAU group ( P<0.001).Conclusions:TGP can treat uveitis in EAU rats by regulating the expression of liver IL-4 and IFN-γ genes and increasing the number of NKT cells.
葡萄膜炎是眼科常见的疾病之一, 常因继发其他眼部疾病而致盲[1]。临床葡萄膜炎的治疗以免疫抑制和抗炎为主[2]。目前对于自身免疫性葡萄膜炎, 尚无确切可靠的治疗方法, 西医治疗多是采用激素或免疫抑制剂治疗, 但药物毒副作用大, 易导致严重的并发症。目前中医传统治疗以清肝泻火为主, 一味攻伐易使肝性失柔, 木失条达, 不利于本病康复。而我们创建的清火柔肝之法是在急性期以清火治标为主, 缓解期以调理脏腑治本为主[3]。所谓“ 柔肝” , 是旨在“ 肝为刚脏, 必柔以济之” , 即以甘缓养血育阴之药以益肝体, 使其条达和畅。芍药甘草汤是常用的柔肝方之一, 而本实验所用的白芍总苷(Total glucosides of peony, TGP)则是植物芍药根中提取的一组糖苷类物质, 芍药苷占90%以上, 是其主要有效成分。临床应用和药理研究发现, TGP具有抑制自身免疫反应、抗炎、止痛、免疫调节等功效, 在多种自身免疫性疾病中得到广泛应用[4]。本研究的实验性自身免疫性葡萄膜炎(Experimental autoimmune uveitis, EAU)是一种主要由细胞介导多种炎症因子紊乱引起的内源性葡萄膜炎的实验模型, 但目前, TGP对EAU的作用机制尚未明确。因此基于“ 柔肝” 理论, 明确TGP在葡萄膜炎治疗领域的机制是确有其必要性的。
自然杀伤T(Natural killer T, NKT)细胞是在淋巴细胞中的一个T细胞的独特子集, 其表型和功能类似NK细胞以及T细胞, 从而表现出先天性及适应性免疫系统的特征[5]。NKT有很多种类, 其中稳定性NKT(iNKT)细胞与自身免疫性疾病发生机制的关系最为紧密, iNKT细胞已被证明涉及广泛的关键性自身免疫应答[6]。iNKT细胞在不同器官中的相对分布是不同的, 在小鼠中, iNKT细胞在肝脏中是最多的, 其次是胸腺、脾、骨髓和淋巴结[3], 因此本研究主要选取肝脏作为主要研究对象。在α 半乳糖神经鞘胺醇(α -Galcer)的刺激下iNKT细胞可以产生大量细胞因子, 从而影响其他淋巴细胞工作, 而在细胞与细胞相接触的情况下, 各细胞之间的互动性, 使整个免疫反应朝向Th1或Th2的方向进行[7, 8]。与T细胞相比, iNKT细胞对细胞因子具有一定的抵抗性, 在对T细胞抗原受体激动剂的反应中可混合IFN-γ 与IL-4的应答效应, 因此认为iNKT在免疫反应中可以发挥多重作用[9]。本研究主要探讨TGP有效减缓葡萄膜炎的作用机制, 观察TGP是否是通过调节肝脏中NKT细胞的数量以及其分泌的因子来治疗葡萄膜炎。
随机选择45只6~8周成年健康SPF级雌性Lewis大鼠[许可证号:SCXK-(京)2016-0006], 体质量120~160 g, 购自北京维通利华实验动物技术有限公司。用随机数字表法将大鼠分为3组, 即正常对照组、EAU模型组和TGP干预组, 每组15只。
采用手提式高速分离液制备乳糜液, 乳糜液中含有光感受器间维生素A结合蛋白(Interphotoreceptor retinoid-binding protein, IRBP)、弗氏完全佐剂(Complete freund's adjuvant, CFA)、结核分枝杆菌H37RA(Tuberculin, TB)和无菌PBS。分别在EAU模型组和TGP干预组大鼠的后肢足垫、两侧腹壁及躯干皮下5点注射800 μ l乳糜液诱导EAU, 正常对照组注射等体积的不含IRBP多肽的乳糜液。
为了模拟临床发病情况, 在炎症反应开始之前即诱导造模后第3天开始灌胃, 对TGP干预组大鼠进行TGP灌胃治疗, 将人的TGP口服剂量换算成大鼠的服药剂量, 换算系数为0.018, 100 ml× 0.018≌ 1.8 ml, 故确定灌胃剂量为3.0 ml/100 g[9], 每日1次, 直至免疫后第28天, 共25 d。
IRBP(1177-1191)购自上海生工生物工程股份有限公司; TB购自美国Difco公司; CFA购自美国Sigma公司; TGP由安徽中医药大学提供; microRNA组织/细胞快速提取试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司; cDNA逆转录试剂盒、2× SYBR Green I试剂盒、北京I试剂盒和Light Cycler® 480实时荧光定量PCR仪购自美国Roche公司; 大鼠IFN-γ 、IL-4蛋白ELISA试剂盒购自武汉基因美生物科技有限公司; 流式细胞仪(FACSVerseTM)购自美国BD公司, PE-IL-17、APC-CD4、PE-IFN-γ 、PE-CD161、FITC-TCR-β 购自美国eBioscience公司; 固定破膜试剂盒购自美国BD公司。
在免疫后每天采用裂隙灯显微镜观察各组大鼠眼前节炎症反应, 记录发病程度, 第12天进行炎症分级:0分为角膜透明, 无炎症反应; 1分为轻度炎症反应, 虹膜和结膜血管轻度扩张; 2分为中度炎症反应, 虹膜、结膜充血并前房闪辉; 3分为重度炎症反应, 虹膜、结膜严重充血, 前房闪辉; 4分为除严重虹膜充血、前房闪辉外, 还出现瞳孔区纤维素渗出。
免疫后第12天取右眼置于10%福尔马林溶液中固定, 进行组织切片, HE 染色, 再进行病理分级:0级为无炎症细胞浸润和正常的视网膜结构; 1级为少量的炎症细胞浸润视网膜伴或不伴光感受器细胞损伤; 2级为外层视网膜光感受器细胞部分的、轻度的破坏; 3级为外层视网膜的中度破坏, 病变累及外核层; 4级为外层视网膜广泛而重度的破坏, 明显炎症反应, 伴内层视网膜的部分破坏, 病变累及内核层; 5级为严重炎症反应, 累及视网膜全层。
分别在免疫后第7、12、21和28天, 随机选取每组3只大鼠安乐处死, 取出大鼠肝脏研磨后分别离心、尼龙毛过滤收集细胞, 然后用大鼠淋巴细胞分离液分离得到单核细胞(每组计数约106个细胞)。细胞表面染色, 染色后滤网过滤, 流式细胞仪检测并分析结果。
免疫后第12天, 随机选取每组3只大鼠安乐处死, 在无菌条件下取其肝脏, 用液氮将肝脏组织研磨, 取适量研磨后的组织按照RNA快速提取试剂盒说明书提取总RNA, 用K5600光分度计检测RNA的纯度和浓度(OD260/OD280:1.8~2.1)。提取的RNA用cDNA反转录试剂盒合成cDNA, 并进行Q-PCR检测, 20 μ l反应体系, 每个基因设3个复孔。β -actin作为目标基因的内参, 各基因引物序列见表1。RT-PCR检测反应结束后, 按照2-△ △ CT计算各基因表达水平, 并对各组数据进行统计学分析。
取大鼠肝脏, 用液氮进行研磨至细粉状, 加入350 μ l TRI pure裂解。用超声波细胞粉碎机冰上超声20 min, 超声后8 000 r/min、4 ℃离心20 min。取上清液测定蛋白浓度, 然后用ELISA试剂盒检测IFN-γ 和IL-4的蛋白表达水平。
实验研究。采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析。所有实验均重复3次。计量资料以± s 表示, 经Levene检验方差齐性, 采用单因素方差分析, 组间两两比较采用LSD-t检验。以P< 0.05为差异有统计学意义。
Genesis-D动物眼部照相机观察发现免疫后EAU模型组大鼠第7天左右开始出现炎症, 表现为虹膜血管轻度扩张充血, 第11~13天表现为虹膜严重充血, 前房重度浑浊, 纤维素性渗出(积脓), 瞳孔膜闭和眼球前突等, 第12天炎症评分最高, 然后自第14天开始眼部炎症逐步缓解, 至第21天眼部炎症基本消退, 第28天眼部炎症完全消退, 见图1。大鼠免疫后第12天, EAU模型组大鼠明显出现眼底炎症, 表现为虹膜血管严重充血扩张, 前房房水重度浑浊, 纤维素性渗出、积脓, 瞳孔膜闭; TGP干预组的炎症情况轻于EAU模型组, 表现为虹膜血管轻度扩张充血。EAU模型组大鼠外层视网膜破坏严重有明显的炎症反应, 而TGP干预组仅有少量炎症细胞浸润, 病理分级明显低于EAU模型组。见图2-3。
免疫后第12天达炎症高峰期。与正常对照组大鼠相比, EAU模型组大鼠NKT细胞水平明显升高, TGP干预组大鼠的NKT细胞水平显著升高, 且高于EAU模型组, 差异有统计学意义(P=0.015)。EAU模型组和TGP干预组的NKT细胞数量均呈上升趋势, 但未达最高点, 在免疫后21 d NKT细胞数量达到高峰, 且TGP干预组在经过TGP刺激后NKT细胞的增长明显高于EAU模型组, 差异有统计学意义(P< 0.001); 在免疫28 d后, 发现NKT数量较21 d降低, 但TGP干预组仍然高于EAU模型组, 差异无统计学意义。见图4-5。
IFN-γ 在TGP干预组大鼠肝脏中表达水平显著高于正常对照组大鼠, 差异有统计学意义(P< 0.001); 但明显低于EAU组, 差异是有统计学意义(P< 0.001); IL-4在TGP干预组中基因表达显著低于正常对照组, 差异有统计学意义(P< 0.001); 但高于EAU模型组, 差异有统计学意义(P< 0.001)。见图6。
免疫后12 d TGP干预组的IFN-γ 蛋白表达高于正常对照组(P< 0.001), 但显著低于EAU模型组大鼠(P< 0.001); TGP干预组IL-4蛋白表达明显高于EAU模型组, 差异有统计学意义(P< 0.001)。见图7。
TGP为柔肝方代表药物的一种, 既往研究表明, TGP能够通过调节炎症因子来调节自身免疫反应, 对系统性红斑狼疮、类风湿关节炎等自身免疫性疾病疗效显著。TGP可使类风湿关节炎患者外周血清IL-10水平升高, IFN-γ 水平降低, IFN-γ 和IL-10分别是Th1细胞和Th2细胞分泌的细胞因子, 提示TGP具有抑制Th1细胞, 增强Th2细胞功能的效应[4]; TGP可使强直性脊柱炎患者血清中IL-6、IL-10和TNF-α 等细胞因子的产生下降[10]。本研究显示正常对照组大鼠的炎症表现随着时间推移显著改变, 提示EAU的炎症损害是一个逐渐加重的过程, 若不加以控制, 病情将会逐渐加重。TGP干预组可以使EAU大鼠的炎症细胞减少, 说明TGP能够改善葡萄膜炎的病情, 起到调节自身免疫系统的作用。
前期研究明确提示自身免疫性葡萄膜炎发生发展的机制与CD4+辅助性T细胞(Th)及其分泌的细胞因子如IL-9、IL-22、IL-17等有密切关系[11], 分泌IFN-γ 的Th1参与迟发型超敏反应的过程, 而Th2细胞产生IL-4, IL-10和IL-13, 并参与体液免疫[12]。尽管Th1和Th2细胞是其各自细胞因子的主要来源, 但免疫系统内外的许多其他细胞(γ -δ 、CD8、自然杀伤细胞和巨噬细胞等)也会分泌这些细胞因子[13]。NKT细胞是一类T细胞免疫调节亚群, 数量和功能与自身免疫疾病密切相关。与其他的T细胞抗原受体(T cell receptor, TCR)基因不同, NKT细胞有其独特的结构特征[14]。NKT细胞抗原识别具有CDld分子的限制性。在NKT细胞的胞浆中己存在IFN-γ mRNA, 所以当NKT细胞表面的受体接受刺激信号后, 立即分泌IFN-γ , 分泌水平是CD4+细胞分泌水平的200倍[14]。活化后的NKT细胞能够快速、大量分泌Th1(IFN-γ )、Th2(IL-4)类细胞因子[15]。有研究证实28.75%的NKT细胞分泌Th1型细胞因子IFN-γ , 约1.32%的NKT细胞同时分泌Th1型细胞因子IFN-γ 和Th2型细胞因子IL-4[16]。CD4+NKT细胞分泌IL-4的量要明显高于CD8+NKT细胞, 至于IFN-γ 的表达水平, 在CD4+NKT细胞和CD8+NKT细胞中比较没有显著差别。在慢性自身免疫中, 启动新的效应T细胞被认为是持续发生的。由于体内存在iNKT细胞的配体, 可以触发iNKT活动, 使iNKT细胞可以参与调节眼部自身免疫疾病的过程[17]。最近, 又有研究者用自身免疫性脑炎模型证明了iNKT细胞可以抑制Th17的分化[18]。Oh等[19]用碳酸脂膜系统和α -半乳糖神经鞘胺醇(α -GalCer)激活的纯化NKT细胞上层培养液的实验结果, 有力地支持了NKT细胞调控系统抑制Th17分化主要依赖细胞接触的观点, 同时证实了NKT细胞生成的IL-4在NKT细胞抑制Th1分化的过程中起主要作用, 并且用EAU模型证实了依赖CD1d的iNKT细胞在控制EAU的进展中有决定性作用[20]。而大量的前期研究证实Th1细胞分泌的IFN-γ 会促进EAU的炎症和病情进展[21]。而且本研究结果也证实了NKT细胞在EAU的发病及病情进展过程中发挥重要的作用。
本研究发现, 在EAU大鼠肝脏中NKT细胞的数目随炎症加剧而急剧增多, 而之后又随炎症减退而减少。而TGP干预组的NKT细胞的数目在第12天时明显高于EAU模型组, 而炎症反应却明显的低于EAU模型组。同时, EAU大鼠血液中IFN-γ 的mRNA表达明显高于正常对照组, 表明IFN-γ 与诱导葡萄膜炎的急性发病有关。而TGP干预组大鼠肝脏中IFN-γ 的mRNA表达在第12天炎症高峰期受到一定程度的抑制。另外, 从TGP干预组和EAU模型组的IL-4的mRNA表达水平可以发现TGP可以促进NKT细胞分泌IL-4, 从而减轻自身免疫反应, 进而减轻葡萄膜炎症。
综上所述, TGP能够减轻大鼠EAU的发病并且加速EAU病情的消退。其机制可能通过刺激NKT细胞产生及调节其相关炎症因子的表达发挥抗炎作用。同时, TGP促进IL-4分泌的同时可以减少IFN-γ 的分泌, 从而加速自身免疫性炎症的消退。
利益冲突申明 本研究无任何利益冲突
作者贡献声明 景常莹:收集数据, 参与选题、设计及资料的分析和解释。宋继科、田庆梅; 根据编辑部的修改意见进行修改。王贝贝、解孝锋、张涛:参与选题、设计和修改论文的结果、结论。毕宏生:参与选题、设计、资料的分析和解释, 修改论文中关键性结果、结论, 根据编辑部的修改意见进行核修
The authors have declared that no competing interests exist.
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