引用本文
沈志华, 左志琴, 彭清华. 灯盏花素抗叔丁基过氧化氢诱导原代大鼠视神经节细胞凋亡[J]. 中华眼视光学与视觉科学杂志, 2018,20(8): 454-460.
Zhihua Shen, Zhiqin Zuo, Qinghua Peng. Protective Effect of Breviscapine on Tert-Butyl Hydroperoxide-induced Primary Retinal Ganglion Cell Apoptosis[J]. CHINESE JOURNAL OF OPTOMETRY OPHTHALMOLOGY AND VISUAL SCIENCE, 2018,20(8): 454-460.  
Doi:10.3760/cma.j.issn.1674-845X.2018.08.002
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灯盏花素抗叔丁基过氧化氢诱导原代大鼠视神经节细胞凋亡
沈志华, 左志琴, 彭清华

410208 长沙,湖南中医药大学 中西医结合学院（沈志华、彭清华）;410208 长沙,湖南中医药大学 中医学院（左志琴）

通讯作者：彭清华（ORCID：0000-0001-9189-0763）,pqh410007@126.com

第一作者：沈志华（ORCID：0000-0002-6437-498X）,szhihua2006@126.com

收稿日期: 2018-01-14
基金资助: 湖南省教育厅科学研究项目(17C1221); 湖南省研究生创新基金资助项目（CX2016B377、CX2017B434、CX2017B426）
摘要
目的 探讨灯盏花素（BVP）对视神经节细胞的保护作用。方法 实验研究。培养大鼠原代视网膜神经节细胞（PRGCs）,采用0、50、100、200 μmol/L叔丁基过氧化氢（tBHP）诱导细胞氧化损伤建立细胞模型（最后选择100 μmol/L建立模型）,给予不同浓度（0、10、20、50 μmol/L）BVP处理后（最终采用20 μmol/L用于后续研究）,检测神经节细胞的改变,免疫印迹法检测细胞凋亡相关因子的改变。采用 t检验进行数据处理。结果 与空白组对照相比,经tBHP处理的PRGCs凋亡明显增加,凋亡相关蛋白Bcl-2（ P<0.05）和神经标志蛋白Synaptophysin（ P<0.01）的表达明显减少。与模型组相比,各治疗组PRGCs成活率明显增加,细胞凋亡减少,Bcl-2和Synaptophysin的表达增加（均 P<0.05）,而Bcl-2相关X蛋白（Bax）的表达（ P>0.05）及Cytochrome C的释放（ P>0.05）及Caspase-3的剪切则被抑制（ P<0.001）。且BVP治疗作用呈剂量依赖性。结论 BVP可以逆转tBHP对视神经节细胞的损伤,减少视神经节细胞的凋亡。

关键词: 灯盏花素; 氧化应激; 视神经节细胞; 细胞凋亡
Protective Effect of Breviscapine on Tert-Butyl Hydroperoxide-induced Primary Retinal Ganglion Cell Apoptosis
Zhihua Shen1, Zhiqin Zuo2, Qinghua Peng1
1School of Integrated Chinese and Western Medicine, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China
2Chinese Medicine School, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China
Corresponding author:Qinghua Peng, School of Integrated Chinese and Western Medicine, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China (Email: pqh410007@126.com)
Abstract

Objective: To observe and explore the protective effects of breviscapine (BVP) on tert-butyl hydroperoxide (tBHP)-induced primary retinal ganglion cell (PRGC) apoptosis.Methods: In this experimental study, PRGCs were isolated by immunopanning from retinas of 1-day-old mice and maintained in culture for 3 days. To induce apoptosis, the PRGCs were then exposed to 0, 50, 100, or 200 μmol/L tBHP (100 μmol/L was chosen to establish models) in the absence or presence of 0, 10, 20, or 50 μmol/L BVP (20 μmol/L was chosen for follow experiments). The PRGCs were identified by immunofluorescence. Expression of Bcl-2, caspase 3, and synaptophysin were assessed by western blotting. Cell apoptosis was detected by the terminal uridine nick-end labeling (TUNEL) assay. Data analysis was performed by t-tests.Results: Compared with the blank control group, the proliferation of PRGCs was significantly inhibited by tBHP ( P<0.05). Cell apoptosis increased ( P<0.01), and the expressions of Bcl-2 and synaptophysin proteins were significantly down-regulated ( P<0.05, P<0.01 respectively). Compared with the tBHP alone, the survival of PRGCs was increased by co-incubation of tBHP with BVP ( P<0.01). Cell apoptosis was reduced, along with expressions of Bax ( P>0.05) and cleaved-caspase-3 ( P<0.001). The protein expressions of Bcl-2 and synaptophysin increased ( P<0.05). The protective effects of BVP on tBHP-induced PRGC apoptosis were achieved in a concentration dependent manner.Conclusions: BVP can inhibit tBHP-induced PRGC apoptosis.

Keyword: breviscapine; oxidative stress; retinal ganglion cells; apoptosis

青光眼是临床常见的双眼可致盲眼疾, 以特征性视盘改变和进行性视野丧失为主的视神经病变, 其组织病理学改变是视网膜神经节细胞（Retina ganglion cells, RGCs）凋亡和轴突丧失[1]。青光眼引起的不可逆性视神经损伤是造成患者失明的主要原因。然而, 目前国内外缺乏对青光眼视神经损伤的有效治疗[2]。氧化应激在青光眼的病理改变中扮演着关键的角色, 尤其是在原发性开角型青光眼（POAG）的发生发展中。各种具有氧化活性的物质不仅可直接损伤RGCs、视网膜神经胶质细胞以及小梁网细胞, 还可以通过触发其他级联反应产生继发性损伤[3]。本课题组在多年的临床实践中发现并归纳出青光眼早中期主要病机为“ 血瘀水停” , 并凝练出中药有效方剂— — 青光安Ⅱ 号方。本研究主要探讨青光安Ⅱ 号方中君药灯盏花的主要成分灯盏花素（Breviscapine, BVP）对大鼠原代视神经节细胞（PRGCs）在氧化应激（Oxidative stress, OS）状态下的保护作用, 为其在防治青光眼视神经退行中的作用提供理论和实验基础。

1 对象与方法
1.1 实验动物

新生24h的SD乳大鼠40只, 购自广东省医学实验动物中心, 雌雄不限, 体质量约5~7 g, 母乳喂养。

1.2 试剂与仪器

BVP注射液（批号：20160925-1）购自昆明龙津药业股份有限公司; 抗B细胞淋巴瘤/白血病-2 （Bcl-2）抗体（批号：A1615）、抗Bcl-2相关X蛋白（Bax）抗体（批号：B1115）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3（Cleaved-caspase-3）抗体（批号：6260）、微管相关蛋白-2（Map2）抗体（批号：130507）、微管蛋白β Ⅲ （β Ⅲ tubulin）抗体（批号：80005）、突泡素（Synaptophysin）抗体（批号：2768）、转录因子Brn3a抗体（批号：128117）和细胞色素C（Cytochrome C）抗体（批号：13156）购自美国Santa Cruz公司; 倒置相差显微镜购自于日本Olympus公司; 电泳仪、转膜仪购自于美国Bio-Rad公司。

1.3 BVP溶液配置

参照文献[4]将市售BVP注射液用含10%胎牛血清的DMEM培养基稀释至目标浓度。

1.4 细胞培养及模型制备

将SD乳鼠放入体积分数为75%的酒精浸泡处死, 沿角巩膜缘剪除角膜, 钝性分离视网膜。分离20只眼的视网膜后, DMEM培养基漂洗干净血液, 再把DMEM培养基小心吸干, 加入0.25%的胰蛋白酶Trypsin, 每10个视网膜加入1 ml, 晃匀后放入37 ℃ 5% CO2培养箱培养15 min, 每隔5 min轻轻吹打1次, 3次后, 将大的碎片吹打破碎, 加入1 ml FBS, 使用400目钢筛过滤后分装种入6孔或24孔板内。分别加入叔丁基过氧化氢（Tert-butyl hydroperoxide, tBHP）0、50、100、200 μ mol/L, 以确定诱导细胞氧化损伤的最佳浓度。确定最佳浓度后, 再向细胞中分别加入BVP 0、10、20、50 μ mol/L, 以确定最佳治疗浓度。

1.5 检测方法

1.5.1 免疫荧光染色 将分离的原代乳鼠PRGCs种入由多聚赖氨酸包被的爬片上, 20 μ mol/L BVP处理后, 吸去24孔板培养基, PBS洗涤5次, 再由4%多聚甲醛固定30 min, 含0.1% Triton× 100 PBS溶液低温破膜处理10 min, PBS洗涤干净后加入5% BSA溶液封闭30 min, 再将稀释好的一抗（Map2、β Ⅲ -tubulin、Brn3a）单独加入或者依据需要复染的种类混合加入, 4 ℃过夜孵育, 然后回收一抗, PBS洗涤6次, 加入Alexa Flour 488和Alexa Flour 647标记的荧光二抗, 锡纸避光在37 ℃孵育1 h, 回收荧光二抗, PBS洗涤6次, 将爬片捞出吸干, 倒扣放置在滴加有抗淬灭封片液的载玻片上, 使用Confocal进行拍照。

1.5.2 蛋白免疫印迹分析 PRGCs细胞接种至6孔板, 每孔的细胞密度为80%左右, 20 μ mol/L BVP预处理细胞6 h后, 然后加入100 μ mol/L tBHP孵育12 h。用蛋白裂解液（RIPA）收集细胞的总蛋白直接用于蛋白免疫印迹分析, 细胞样本用碧云天产线粒体分离试剂盒及核蛋白分离试剂盒进行分离, 分离方法参考试剂盒说明书, 分别分离无线粒体的胞浆及细胞核。BCA法定量后上样, 每孔细胞总蛋白的上样量为10 μ g, 用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离, 然后转移至硝酸纤维素膜。用含0.1%的Tris缓冲液（TBST）的5%脱脂奶粉室温封闭2 h, 再进行一抗4 ℃孵育过夜, TBST洗涤后, 二抗在室温孵育1 h, TBST洗涤后显影。

1.5.3 PRGCs凋亡率检测 用TUNEL细胞凋亡检测试剂盒进行PRGCs凋亡率检测。细胞先用1%多聚甲醛室温固定10 min, 浸洗后再用预冷的乙醇醋酸溶液于-20 ℃再固定5 min; 然后滴加平衡液Equilibration Buffer以及TdT工作液, 盖上塑料盖玻片, 湿盒中37 ℃孵育1 h, 再放入终止液以终止反应, 滴加荧光抗体工作液, DAPI复染, 抗荧光衰减封片剂封片, 激光共聚焦显微镜下观察染色结果（阳性细胞标记为绿色, DAPI 标记细胞核为蓝色）。每张切片随机选取5个高倍镜视野（× 200）, 所采集的每幅图像都尽量包含相同的细胞数目, 以阳性细胞百分数来表示凋亡率。

1.6 统计学方法

实验研究。采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析。所有结果用 ± s 来表示。2组间的比较采用独立样本t检验, 所有统计检验均采用双侧检验。以P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 细胞鉴定

对PRGCs细胞特征蛋白Map2、β Ⅲ -tubulin、Brn3a进行免疫荧光染色, 得到培养的大鼠原代细胞确实为RGCs细胞, 见图1。

图1. 视网膜神经节细胞鉴定图(× 400)
A：Brn3a; B：β Ⅲ -tubulin; C：Map2; D：混合图像Figure 1. Retina ganglion cells identification (× 400).
A: Brn3a; B: β Ⅲ -tubulin; C: Map2; D: Merged.

2.2 不同浓度tBHP对PRGCs细胞活性的影响

采用0、50、100、200 μ mol/L tBHP造模, 观察凋亡相关蛋白Bcl-2、Cleaved-caspase-3和神经标志蛋白Synaptophysin表达, 进行灰度值分析。结果显示, tBHP在100 μ mol/L时, 对PRGCs就已经造成显著损伤, 而tBHP达到200 μ mol/L后, PRGCs在白光下可见细胞凋亡严重, 影响后续给药操作, 因此选择100 μ mol/L tBHP作为毒性处理浓度, 见图2。

图2. 不同浓度tBHP对PRGCs细胞活性的影响
与正常组（0 μ M）相比, aP< 0.05, bP< 0.01, cP< 0.001。tBHP, 叔丁基过氧化氢; PRGCs, 原代视网膜神经节细胞; μ M, μ mol/LFigure 2. Dose-dependent effect of tBHP on apoptosis of PRGCs.
Compared with control group (0 μ M), aP< 0.05, bP< 0.01, cP< 0.001. tBHP, tert-butyl hydroperoxide; PRGCs, primary retinal ganglion cells; GAPDH, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (loading control); μ M, μ mol/L.

2.3 不同浓度BVP对tBHP诱导的PRGCs损伤的保护作用

根据tBHP的浓度梯度结果, 选择100 μ mol/L tBHP进行BVP浓度梯度筛选, 分析PRGCs凋亡相关蛋白Bcl-2、Cleaved-caspase-3和神经标志蛋白Synaptophysin表达量及灰度值。如图3所示, tBHP在100 μ mol/L浓度, BVP在给药浓度为10、20、50 μ mol/L的时候对神经均有保护作用, 而且这种保护作用有着显著的剂量依赖, 证明BVP促进神经发育。而蛋白免疫印迹结果显示, 给药20、50 μ mol/L BVP后, Synaptophysin的表达量比正常对照组都要高, 且50 μ mol/L BVP明显高于正常对照组, 因此选择20 μ mol/L的BVP进行后续的药物机制研究。

图3. 不同浓度BVP对tBHP（100 μ mol/L）诱导的PRGCs损伤的影响
与模型组（tBHP+, BVP 0 μ M）相比, aP< 0.05, bP< 0.01, cP< 0.001。BVP, 灯盏花素; tBHP, 叔丁基过氧化氢; PRGCs, 原代视网膜神经节细胞; μ M, μ mol/LFigure 3. Dose-dependent effect of BVP on tBHP (100 μ M tBHP)-induced PRGC apoptosis.
Compared with tBHP group (tBHP+, BVP 0 μ M), aP< 0.05, bP< 0.01, cP< 0.001. BVP, breviscapine; tBHP, tert-butyl hydroperoxide; PRGC, primary retinal ganglion cell; GAPDH, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (loading control); μ M, μ mol/L.

2.4 20 μ mol/L BVP对tBHP诱导的PRGCs凋亡的保护作用

通过对凋亡相关蛋白Bcl-2、Cleaved-caspase-3、Bcl-2相关X蛋白（Bax）表达量影响以及灰度值分析, 20 μ mol/L BVP能够显著逆转100 μ mol/L tBHP诱导的凋亡相关蛋白的变化, 通过分离细胞胞浆和线粒体蛋白, 蛋白免疫印迹结果显示, tBHP能够造成PRGCs Cytochrome C从线粒体释放到胞浆, 而BVP能够逆转Cytochrome C的释放和转位, 抑制tBHP诱导的线粒体凋亡, 说明BVP具有保护PRGCs、抑制凋亡的作用, 见图4。

图4. BVP对tBHP诱导的大鼠视网膜神经节细胞凋亡的保护作用
tBHP为100 μ mol/L, BVP为20 μ mol/L。与模型组相比, aP< 0.05, bP< 0.01, cP< 0.001。BVP, 灯盏花素; tBHP, 叔丁基过氧化氢Figure 4. Protection by BVP of tBHP-induced PRGC apoptosis.
Compared with tBHP group, aP< 0.05, bP< 0.01, cP< 0.001. BVP, breviscapine (20 μ mol/L); tBHP, tert-butyl hydroperoxide (100 μ mol/L); PRGC, primary retinal ganglion cell.

2.5 各组PRGCs凋亡率比较

如图5所示, 正常对照组、tBHP组、tBHP+BVP组的凋亡率分别为（2.2± 0.8）%、（76.5± 10.3）%、（28.6± 12.1）%, 说明BVP能够显著抗氧化应激诱导的细胞凋亡。

图5. BVP对tBHP诱导的大鼠视网膜神经节细胞凋亡的影响(TUNEL, × 200)
tBHP为100 μ mol/L, BVP为20 μ mol/L。与模型组相比, cP< 0.001。BVP, 灯盏花素; tBHP, 叔丁基过氧化氢Figure 5. Effect of BVP on tBHP-induced PRGC apoptosis (TUNEL, × 200).
Compared with tBHP group, cP< 0.001. BVP, breviscapine (20 μ mol/L); tBHP, tert-butyl hydroperoxide (100 μ mol/L); PRGC, primary retinal ganglion cell; TUNEL, the terminal uridine nick-end labeling; DAPI, 4', 6-diamidino-2-phenylindole.

3 讨论

灯盏花（灯盏细辛）菊科植物短葶飞蓬的干燥全草。夏秋二季采挖。辛, 微苦, 温。归心经、肝经。具有活血通络止痛, 祛风散寒的功效。用于中风偏瘫、胸痹心痛、风湿痹痛、头痛及牙痛[5]。现代研究证实灯盏花具有扩张细微血管, 降低血管外周阻力, 增加心脑血流量, 改善微循环, 抗血小板聚集等药理作用。临床多用于治疗缺血性脑血管病[6]。近年来灯盏花用于治疗青光眼等眼科疾病, 发现其作用机制与视神经保护作用有关, 具体为改善视神经轴浆运输[7]、促进小梁细胞增殖, 降低小梁细胞分泌细胞外基质、扩张血管[8], 改善视乳头和视网膜血液循环[9]、抑制缺血诱导神经元凋亡等[10]。

OS是指机体遭受刺激时, 体内高活性分子产生过多, 氧化能力超出自身氧化物的清除能力, 氧化系统和抗氧化系统失衡, 从而导致组织病理损伤[11, 12]。OS在青光眼的病理改变中扮演着关键的角色, 尤其是在POAG的发生发展中。各种具有氧化活性的物质不仅可直接损伤RGCs、视网膜神经胶质细胞以及小梁网细胞, 还可以通过触发其他级联反应产生继发性损伤。OS通过外源性和内源性途径促进RGCs凋亡[3, 13, 14]。在细胞凋亡过程中, 线粒体Cytochrome C的释放起重要作用, Cytochrome C释放到胞质后可引发Caspase活化级联, 导致细胞死亡[13, 15]。Bcl-2 蛋白家族具有调控Cytochrome C释放的功能[13]。

本研究观察BVP对大鼠PRGCs在氧化应激状态下的保护作用。首先, 采用tBHP处理大鼠PRGCs模拟氧化应激损伤。运用tBHP处理细胞以模拟氧化应激损伤是较常用的细胞模型之一, 具有可重复性和较高稳定性。结果显示, 经tBHP处理后, 神经标志蛋白Synaptophysin的表达明显下降, 这与Lu等[16]研究结果一致。经BVP治疗后, Synaptophysin的表达明显增加, 且随着BVP浓度的增加而增加。证实BVP对神经具有保护作用, 而且这种保护作用有着显著的剂量依赖性。其次, 观察了BVP对凋亡相关蛋白Bcl-2、Cleaved-caspase-3、Bax表达量的影响, 结果显示, 经tBHP处理后, Bax、Cleaved-caspase-3表达量增加, Bcl-2表达量下降, 这与刘立萍等[17]研究结果一致。经BVP治疗后, Bax、Cleaved-caspase-3表达量下降, Bcl-2表达量增加, 说明BVP可以通过调节Bcl-2蛋白家族继而控制Cytochrome C释放, 逆转tBHP造成PRGCs Cytochrome C从线粒体释放到胞浆, 抑制tBHP诱导的线粒体凋亡途径, 达到保护PRGCs、抑制凋亡的作用。最后, TUNEL检测PRGCs凋亡率结果显示, BVP能够显著抗氧化应激诱导的细胞凋亡。

本研究采用tBHP处理大鼠PRGCs模拟氧化应激损伤, 初步证实灯盏花具有缓解tBHP诱导的PRGCs凋亡作用, 这为今后药物治疗青光眼视神经病变提供了部分理论依据和实验研究的基础。但其具体作用机制尚不明确, 是否与灯盏花改善循环、扩张血管和抗炎有关, 还需下一步研究证实。

利益冲突申明 本研究无任何利益冲突

作者贡献声明 沈志华：收集数据、参与选题、设计及资料的分析和解释; 实验操作; 撰写论文; 根据编辑部的意见进行修改。左志琴、彭清华：参与选题、设计、资料的分析和解释, 修改论文中结果、结论; 根据编辑部的修改意见进行核修

The authors have declared that no competing interests exist.

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