引用本文
李雪丽, 唐由之, 许凯, 陈强, 梁洁, 王晶莹, 梁丽娜. 补肾益精方对外周血干细胞在RCS大鼠视网膜上的募集及睫状神经营养因子表达的影响[J]. 中华眼视光学与视觉科学杂志, 2018,20(8): 475-483.
Xueli Li, Youzhi Tang, Kai Xu, Qiang Chen, Jie Liang, Jingying Wang, Lina Liang. Bu Shen Yi Jing Fang Recruitment of Peripheral Blood Stem Cells to the Retina of RCS Rats and Expression of Retinal Ciliary Neurotrophic Factor[J]. CHINESE JOURNAL OF OPTOMETRY OPHTHALMOLOGY AND VISUAL SCIENCE, 2018,20(8): 475-483.  
Doi:10.3760/cma.j.issn.1674-845X.2018.08.005.
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补肾益精方对外周血干细胞在RCS大鼠视网膜上的募集及睫状神经营养因子表达的影响
李雪丽, 唐由之, 许凯, 陈强, 梁洁, 王晶莹, 梁丽娜
100040 北京,中国中医科学院眼科医院
通讯作者：梁丽娜（ORCID：0000-0003-2408-7852）,lianglina163@163.com

第一作者：李雪丽（ORCID：0000-0001-6848-6906）,lixuli1801@163.com

收稿日期: 2018-05-13
基金资助: 国家自然科学基金(81473736,81674033）; 国家人力资源和社会保障部留学人员科技活动择优项目（2010-94）; 中国中医科学院“一带一路”合作专项课题（GH2017-04-02）
摘要

目的 观察补肾益精方对外周血骨髓间充质干细胞在视网膜变性模型（RCS）大鼠视网膜募集及睫状神经营养因子（CNTF）分泌的影响,探讨补肾益精方治疗视网膜退行性病变的作用机制。方法 实验研究。采用尾静脉注射方式将1×107个GFP标记的骨髓间充质干细胞（GFP-MSCs）注射至3周龄RCS大鼠外周血,然后按随机数字表法分为蒸馏水组及补肾益精方（BSYJ）组,每组39只。注射后第1天开始分别采用蒸馏水及补肾益精方药液灌胃,正常SD大鼠作为对照组常规饲养。给药7 d、14 d及28 d时分别采用视网膜铺片、免疫荧光显微镜观察GFP-MSCs在视网膜的募集情况;实时荧光定量PCR及免疫荧光双染技术检测视网膜表达CNTF的情况;TUNEL法检测视网膜细胞凋亡情况;采用单因素方差进行数据分析。结果 给药7 d、14 d和28 d时,蒸馏水组GFP-MSCs的数目少于BSYJ组,其中给药28 d时,2组差异有统计学意义（ t=2.71, P=0.001）。给药7 d、14 d和28 d时,BSYJ组CNTF表达较蒸馏水组均明显增加,3组差异有统计学意义（ F=5.763, P=0.003; F=3.165, P=0.042; F=4.839, P=0.004）。给药7 d和28 d时,BSYJ组视网膜细胞凋亡率明显少于蒸馏水组,3组差异有统计学意义（ F=0.002, P=0.001; F=0.307, P=0.004）。结论 补肾益精方能够促进外周血干细胞在视网膜上的募集以及促进CNTF的表达,这可能是补肾益精方延缓RCS大鼠视网膜细胞凋亡和病变进程的作用机制之一。

关键词: 补肾益精方; 骨髓间充质干细胞; 睫状神经营养因子; 视网膜色素变性
Bu Shen Yi Jing Fang Recruitment of Peripheral Blood Stem Cells to the Retina of RCS Rats and Expression of Retinal Ciliary Neurotrophic Factor
Xueli Li, Youzhi Tang, Kai Xu, Qiang Chen, Jie Liang, Jingying Wang, Lina Liang
Eye Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing, 100040, China
Corresponding author:Lina Liang, Eye Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing, 100040, China (Email: lianglina163@163.com)
Fund:National Natural Foundation of China (81473736, 81674033); Ministry of Human Resources and Social Security of PRC (2010-94); TCM “Belt and Road Initiative” Cooperative Project Funded by China Academy of Chinese Medical Sciences (GH2017-04-02)
Abstract

Objective: To measure recruitment of bone marrow-derived mesenchymal stem cells from peripheral blood to the retina of royal college of surgeon (RCS) rats and the expression of ciliary neurotrophic factor (CNTF). We also investigated the mechanism by which Bu Shen Yi Jing Fang (BSYJ) could treat retinal degenerative diseases.Methods: This was an experimental study. RCS rats were injected with 1×107green fluorescent protein- (GFP-) labeled bone marrow-derived mesenchymal stem cells (GFP-MSCs). The injected rats were assigned to a distilled water group or a BSYJ group according to selection from a random number table, and 39 rats in each group. Each rat in the respective groups was gavaged with either distilled water or BSYJ solution one day after injection. Normal SD rats were treated routinely as the control group. At 7, 14, and 28 days after treatment, retina flat mounts were prepared to assess the recruitment of GFP-MSCs to the retina. Quantitative polymerase chain reaction (Q-PCR) and immunofluorescence double labeling were used to determine the effect of BSYJ on expression of ciliary neurotrophic factor (CNTF) in the retina. Apoptosis of retinal cells was measured by the TUNEL method. Data were analyzed using ANOVA.Results: At 7, 14, and 28 days after treatment, the numbers of GFP-MSCs in the distilled water group were less than in the BSYJ group, and the difference was significant at 28 days ( t =2.71, P=0.001). At 7, 14, and 28 days after treatment, CNTF mRNA expression in the BSYJ group was significantly higher than in the distilled water group ( F=5.763, P=0.003; F=3.165, P=0.042; F=4.839, P=0.004). At 7 and 28 days after treatment, the apoptosis rate of retinal cells in BSYJ group was significantly less than in the distilled water group ( F=0.002, P=0.001; F=0.307, P=0.004).Conclusions: BSYJ improved recruitment of peripheral blood stem cells to the retina and increased CNTF expression. The recruitment of stem cells by BSYJ may delay progression of retinal cell apoptosis and degeneration in RCS rats.

Keyword: Bu Shen Yi Jing Fang; marrow-derived mesenchymal stem cells; ciliary neurotrophic factor; retinitis pigmentosa

视网膜色素变性（Retinitis pigmentosa, RP）是严重的致盲性眼病, 主要表现为光感受器细胞和色素上皮细胞进行性损伤而导致的视功能障碍, 目前尚无有效的治疗方法[1]。近年来, 细胞替代治疗方法的出现, 尤其是干细胞研究的快速发展使视网膜退行性疾病的修复和治疗成为可能, 亦给众多患者带来了复明的希望[2]。除了移植外源性干细胞修复变性的视网膜组织外, 促进机体自身固有的干细胞自我修复在近几年成为新的研究热点。补肾益精方（Bu Shen Yi Jing Fang, BSYJ）是唐由之研究员多年临床治疗RP的经验方, 前期实验研究发现该方对先天性视网膜变性模型（Royal college surgeon, RCS）大鼠的视网膜变性具有一定保护作用, 并可以动员自体骨髓干细胞至外周血[3, 4]。在此基础上, 本研究拟观察补肾益精方是否可以促使外周血的干细胞向视网膜募集及视网膜睫状神经营养因子（Ciliary neurotrophic factor, CNTF）的分泌, 探讨该方对RCS大鼠视网膜变性的保护机制。

1 对象与方法
1.1 实验动物

SD大鼠, 雄性, 3周龄, 36只, 由北京维通利华实验动物技术有限公司[动物许可证号：SCXK（京）2012-0001]提供; RCS大鼠, 雄性, 3周龄, 78只, 由中国医学科学院医学实验动物研究所[动物许可证号：SCXK（京）2013-0002]提供。均饲养于屏障环境, 室温控制在20~26 ℃, 相对湿度控制在40%~70%, 自动控制光照12 h明暗交替。

1.2 试剂与仪器

补肾益精方由制首乌、黄精、菟丝子、黄芪等组成, 所有中药材均来自中国中医科学院眼科医院中药房, 水提浓缩液由中国中医科学院眼科医院药学部制备而成, 生药浓度为0.88 g/ml。

绿色荧光蛋白标记的大鼠骨髓间充质细胞（Green fluorescent protein labeled bone marrow-derived mesenchymal stem cells, GFP-MSCs）购自广州Cyagen公司; Anti-CNTF 抗体（ab46172）、Anti-BDNF抗体（ab101747）、Anti-GFP抗体（ab13970）、Alexa Fluor® 647标记的羊抗兔IgG H& L（ab150079）、Alexa Fluor® 488标记的羊抗鸡 IgG H & L（ab150169）购自美国Abcam公司; In Situ Cell Death Detection Kit、TMR red（12156792910）购自德国Roche公司; Trizol® Reagent RNA提取试剂盒（15596018）购自美国Life Technologies Corporation公司; M-MLV Reverse Transcriptase cDNA第一链合成试剂盒（28025-013）购自美国Invitrogen公司; Real Master Mix（SYBR Green） （151105P1105H）购自北京天根生化科技有限公司; Recombinant DNase I（D2270A）购自日本TAKARA公司。

Life-Tech 7500实时荧光定量PCR仪购自美国Applied Biosystems公司; Nanodrop 2000超微量紫外分光光度计购自美国Thermo Fisher公司; CM1850冷冻切片机、EG1150模块化组织包埋中心HI1210、DM2500显微镜购自德国Leica公司。

1.3 GFP-MSCs移植

所有RCS大鼠均接受GFP-MSCs移植, 采用尾静脉注射移植法, 每只大鼠单次尾静脉注射GFP-MSCs 1× 107个细胞。

1.4 分组及给药

RCS大鼠接受细胞移植后第1天随机分为蒸馏水组和BSYJ组, 每组39只。BSYJ组灌胃给予BSYJ 8.8 g/kg, 每日1次, 蒸馏水组给予灌服等量的蒸馏水, 分别于给药后7 d、14 d、28 d后进行指标检测。正常SD大鼠常规饲养作为对照组。

1.5 检测方法

1.5.1 视网膜铺片观察 在各个观察点每组随机选取6只大鼠, 水合氯醛过量麻醉法处死, 立即摘除眼球, 去除眼前节、玻璃体及视网膜神经上皮层, 将剩余的眼杯转移至含有PBS的32 mm培养皿中, 清洗后, 做4~6个放射状切口, 平铺在载玻片上, 采用水性封片剂封片后, 于荧光显微镜下观察。设置激发光为475 nm, 发射光为509 nm, 观察GFP-MSCs在视网膜的分布并计数。

1.5.2 实时荧光定量PCR检测 水合氯醛过量麻醉法处死大鼠, 迅速取大鼠视网膜置于1.5 ml离心管中, 按照RNA提取试剂盒说明书提取视网膜组织样本中总RNA, 采用紫外分光光度计测定浓度。用M-MLV Reverse Transcriptase cDNA第一链合成试剂盒型进行逆转录反应合成cDNA。以β -actin为内参, 各引物基因序列为：β -actin正义链5′ -AATGAGGCTGGTGATAAA-3′ , 反义链5′ -GCAAAGAGGGCAAGAA-3′ ; CNTF正义链5′ -TGACTGAGGCAGAGCG-3′ , 反义链5′ -AGGCAAAGGCAGAAAC-3′ ; 扩增条件：95 ℃进行预变性30 s, 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 15 s, 72 ℃ 15 s, 45个循环。

1.5.3 免疫荧光双染检测 水合氯醛过量麻醉法处死大鼠, 立即摘出眼球, 于4%多聚甲醛液中4 ℃固定, OCT包埋迅速冷冻。标本在-23 ℃下行垂直视网膜的8 μ m冰冻切片。一抗孵育（Anti-CNTF, 1∶ 250; Anti-GFP, 1∶ 1000）, 4 ℃过夜; PBST洗涤3次, 每次10 min; 二抗孵育（Alexa Fluor® 647标记的山羊抗兔IgG抗体1∶ 500, Alexa Fluor® 488标记的羊抗鸡IgG抗体1∶ 500）, DAPI复染, 抗荧光衰减封片剂封片, 倒置显微镜下观察并拍照, Iamge ProPlus 6.0软件分析荧光强度。

1.5.4 TUNEL法检测 采用末端脱氧核糖核甘酸转移酶（Terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT）介导的地高辛标记的dUTP缺口末端标记
（TdT-mediated dUTP nick end labeing, TUNEL）法检测视网膜组织中凋亡细胞。计数每个视野内凋亡阳性细胞数和总细胞数, 计算凋亡率=凋亡阳性细胞数/总细胞数× 100%, 然后进行统计分析。

1.6 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析。所有数据符合正态分布且方差齐性, 均数以 ± s 表示, 组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）, 两两比较采用LSD-t检验。以P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 补肾益精方对GFP-MSCs在视网膜募集的影响

对照组大鼠没有进行GFP-MSCs移植, 荧光显微镜观察未见绿色荧光着染细胞。BSYJ组和蒸馏水组大鼠视网膜铺片可见呈绿色的GFP-MSCs, 且BSYJ组多于蒸馏水组, 见图1。GFP-MSCs计数结果显示, 给药7 d和14 d时BSYJ组和蒸馏水组GFP-MSCs细胞数差异无统计学意义（t=0.734, P=0.470; t=0.810, P=0.421）; 给药28 d时BSYJ组的GFP-MSCs细胞数较蒸馏水组明显增加, 两者差异有统计学意义（t=2.71, P=0.001）, 见表1。

图1. 荧光显微镜观察SD大鼠和RCS大鼠视网膜铺片中绿色荧光蛋白标记的骨髓间充质干细胞（× 400）
Control：正常SD大鼠组; Vehicle：RCS大鼠蒸馏水组; BSYJ：RCS大鼠补肾益精方组。SD, 斯泼累格· 多雷; RCS, 先天性视网膜变性模型; GFP-MSCs, 绿色荧光蛋白标记的骨髓间充质干细胞Figure 1. Fluorescence microscopy of GFP-MSCs in retinal flat mounts of SD rats and RCS rats (Magnification: × 400).
Control: Normal SD rat group; Vehicle: Distilled water group; BSYJ: Bu Shen Yi Jing Fang group. SD, Sprague-Dawley; RCS, royal college of surgeon; GFP-MSC, green fluorescence protein-labeled mesenchymal stem cells (stained green).

表1 各组大鼠视网膜铺片GFP-MSCs细胞数目 Table 1 GFP-MSCs numbers in retina flat mount in different groups
2.2 视网膜中CNTF mRNA表达情况

给药7 d、14 d、28 d时, BSYJ组视网膜中CNTF的mRNA表达比正常组少, 但明显多于蒸馏水组中的表达, 3组差异具有统计学意义（F=5.763, P=0.003; F=3.165, P=0.042; F=4.839, P=0.004）, 见图2。

图2. 补肾益精方对RCS大鼠视网膜CNTF mRNA表达的影响（x-± s, n=6）
Control：正常SD大鼠组; Vehicle：RCS大鼠蒸馏水组; BSYJ：RCS大鼠补肾益精方组。与蒸馏水组比较, aP< 0.05, bP< 0.01。SD, 斯泼累格多雷; RCS, 先天性视网膜变性模型; CNTF, 睫状神经营养因子Figure 2. Effect of BSYJ on the expression of CNTF mRNA in the retina of RCS rats.
Control: Normal SD rat group; Vehicle: Distilled water group; BSYJ: Bu Shen Yi Jing Fang group. SD, Sprague-Dawley; RCS, royal college of surgeons; CNTF, ciliary neurotrophic factor. Compared with distilled water group, aP< 0.05, bP< 0.01; n=6.

2.3 视网膜中CNTF蛋白表达情况

在给药7 d、14 d和28 d时, 对照组大鼠视网膜中CNTF均有较强的表达, 主要分布在神经节细胞层; BSYJ组大鼠视网膜中有较弱表达, 但高于蒸馏水组, 蒸馏水组中表达较少, 除神经节细胞层外, 视网膜内核层、外核层也可见少量阳性细胞, 部分细胞呈现绿色及红色双染阳性。见图3-5。

图3. 治疗7 d后各组大鼠视网膜组织中CNTF蛋白表达的改变（× 400）
Control, 正常SD大鼠; Vehicle, RCS大鼠蒸馏水灌胃组; BSYJ, RCS大鼠补肾益精方灌胃组。绿色荧光蛋白标记的骨髓间充质干细胞（GFP-MSCs）呈绿色染色, 睫状神经营养因子（CNTF）呈红色染色Figure 3. Expression of CNTF protein in different groups after 7 days′ treatment (Magnification: × 400).
Control: normal SD rat; Vehicle: distilled water group; BSYJ: Bu Shen Yi Jing Fang group. GFP-MSCs, green fluorescence protein-labeled mesenchymal stem cells (stained green); CNTF, ciliary neurotrophic factor (stained red).

图4. 治疗14 d后各组大鼠视网膜组织中CNTF蛋白表达的改变（× 400）
Control, 正常SD大鼠; Vehicle, RCS大鼠蒸馏水灌胃组; BSYJ, RCS大鼠补肾益精方灌胃组。绿色荧光蛋白标记的骨髓间充质干细胞（GFP-MSCs）呈绿色染色, 睫状神经营养因子（CNTF）呈红色染色Figure 4. Expression of CNTF protein in different groups after 14 days′ treatment (Magnification: × 400).
Control: normal SD rat; Vehicle: distilled water group; BSYJ: Bu Shen Yi Jing Fang group. GFP-MSCs, green fluorescence protein-labeled mesenchymal stem cells (stained green); CNTF, ciliary neurotrophic factor (stained red).

图5. 治疗28 d后各组大鼠视网膜组织中CNTF蛋白表达的改变（× 400）
Control：正常SD大鼠; Vehicle：RCS大鼠蒸馏水组; BSYJ：RCS大鼠补肾益精方组。绿色荧光蛋白标记的骨髓间充质干细胞（GFP-MSCs）呈绿色染色, 睫状神经营养因子（CNTF）呈红色染色Figure 5. Expression of CNTF protein in different groups after 28 days′ treatment (Magnification: × 400).
Control: Normal SD rat; Vehicle: Distilled water group; BSYJ: Bu Shen Yi Jing Fang group. GFP-MSCs, green fluorescence protein-labeled mesenchymal stem cells (stained green); CNTF, ciliary neurotrophic factor (stained red).

2.4 视网膜细胞凋亡情况

TUNEL检测显示, 各观察时间点对照组SD大鼠视网膜均未见凋亡细胞, 给药7 d和28 d时, BSYJ组视网膜细胞凋亡率明显低于蒸馏水组, 3组差异有统计学意义（F=0.002, P=0.001; F=0.307, P=0.004）, 见表2。

表2 各组大鼠视网膜细胞凋亡率 Table 2 Cell apoptosis rates in different groups
3 讨论

干细胞是一类具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体, 根据细胞来源可分为胚胎干细胞及成体干细胞, 后者包括骨髓来源干细胞、神经干细胞、视网膜干细胞及诱导多潜能干细胞（Induced pluripotent stem cell, iPS）等[5]。其中骨髓来源干细胞由于其来源广泛, 易于分离培养, 并且具有较强的分化潜能和可自体移植等优点, 越来越受到学者们的青睐, 被认为是用于临床治疗的最优干细胞[6, 7]。

近来研究发现机体外周血中存在骨髓干细胞, 这些细胞在病理情况下能自发向损伤部位募集并参与组织修复[8, 9, 10], 但通常进入到外周血循环中的骨髓干细胞数量非常少, 对组织的修复作用极为有限, 但这个发现提示人们或许可以通过一些药物或其他方法激发和促进自体干细胞参与受损组织的修复。Machaliń ska等[11]采用碘酸钠诱导视网膜变性损伤, 观察到骨髓中的干细胞可以被动员至外周血中, 并进一步在受损视网膜中归巢, 但TUNEL及视网膜电生理检测显示这种方法尚不足以重建视网膜功能。中医学认为, 精是生命的根源物质, 精气藏于肾。《素问阴阳应象大论》记载：“ 气归精、精归化” , 所谓化就是能化生出身体的各种脏器组织及气血津液等所有成分, 故具有再生的意义, 这与多潜能干细胞在内涵与功能上具有很大的相似性[12]。因此, 通过补肾益精治疗, 有可能通过促进自身干细胞的增殖分化能力, 从而达到修复再生组织、恢复组织功能的作用。补肾益精方是唐由之研究员根据多年治疗RP经验总结的基本方, 方药组成包括制首乌、黄精、菟丝子、黄芪等。其中制首乌补肝肾、益精血, 黄精益肾健脾、填精髓, 枸杞子补肾明目, 黄芪健脾益气, 诸药合用共奏补
肾健脾、益精明目之效。现代药理学研究显示, 黄精可以促进骨髓间充质干细胞的增殖及动员[13]; 菟丝子亦有促进骨髓间充质干细胞增殖的作用[14], 黄芪还可以促使骨髓间充质干细胞向神经细胞转化[15]。在我们前期研究发现BSYJ组RCS大鼠外周血骨髓干细胞动员较对照组增加[4]。而本研究显示BSYJ组RCS大鼠视网膜中的骨髓间充质干细胞亦较蒸馏水组明显增多, 提示该方不仅可以促进骨髓干细胞动员至外周血中, 而且可以促使外周血干细胞在大鼠视网膜的聚集。卓丽红等[16]发现制首乌含药血清可以促进造血干细胞的增殖及骨髓细胞黏附因子的表达。因此, 我们推测补肾益精方可能通过促进趋化和黏附因子的表达, 从而促进外周血干细胞在视网膜的募集。

以往研究显示, 骨髓来源干细胞修复视网膜变性损伤可能通过几下几种机制：在病变部位分化为视网膜色素上皮细胞（RPE）或感光细胞, 直接替代修复死亡的细胞; 通过分泌神经生长因子、抑制细胞凋亡来保护受损细胞[17]。Wang等[18]将骨髓间充质干细胞通过尾静脉注射入RCS大鼠外周血中, 结果显示与未注射骨髓间充质干细胞组相比, 移植组大鼠感光细胞数明显增多, 视网膜内CNTF的表达较对照组增加。本研究发现BSYJ组大鼠视网膜细胞凋亡率较蒸馏水组明显降低, 视网膜中CNTF mRNA水平明显增加, 免疫荧光结果显示募集至视网膜的骨髓间充质干细胞表达CNTF增强, 提示补肾益精方具有保护视网膜细胞凋亡和促进CNTF表达作用。CNTF是细胞因子家族中被研究最多的成员之一, 大量研究已经表明, CNTF对神经元、少突胶质细胞、肌细胞、骨细胞、脂肪细胞具有营养性和调节活性[19]。目前, 已在至少13种不同的动物模型中得到证实CNTF可以有效延缓RP进程[20]。而以往的药理学研究显示, 补肾益精方中黄芪的有效成分黄芪多糖、黄芪甲苷及黄精有效成分黄精多糖对应激反应引起的RPE细胞、心肌细胞、脑组织神经细胞的凋亡有很好的保护作用[21, 22, 23], 黄芪注射液及黄精多糖还可以促进海马神经元细胞释放脑源性神经影响因子[24, 25], 为本研究提供了理论支持。

综上所述, 本研究初步证实补肾益精方对RCS大鼠视网膜变性有较好的干预作用, 其作用机制可能与促进外周血干细胞在视网膜募集及分泌CNTF、延缓视网膜神经细胞凋亡有关, 具体的分子机制及募集在视网膜的骨髓干细胞是否能进一步分化为视网膜细胞有待进一步探讨。

利益冲突申明 本研究无任何利益冲突

作者贡献声明 李雪丽：参与课题设计、实验操作、收集数据, 资料的分析和撰写论文。唐由之：参与选题、课题设计和指导修改论文。许凯：参与实验操作、收集数据, 资料的分析。陈强、梁洁：参与实验操作、收集数据。王晶莹：参与实验操作、收集数据, 根据编辑部的修改意见进行核修。梁丽娜：参与选题、设计、资料的分析和解释, 撰写论文, 根据编辑部的修改意见进行修改

The authors have declared that no competing interests exist.

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