引用本文
叶海昀, 兰小平, 乔彤. 双胞胎早产儿视网膜病变与 NDP/ FZD4基因相关分析 [J]. 中华眼视光学与视觉科学杂志, 2018,20(9): 552-555.
Haiyun Ye, Xiaoping Lan, Tong Qiao. Correlation Analysis between Retinopathy of Prematurity in Twins and the NDP/ FZD4 Gene [J]. CHINESE JOURNAL OF OPTOMETRY OPHTHALMOLOGY AND VISUAL SCIENCE, 2018,20(9): 552-555.  
Doi: 10.3760/cma.j.issn.1674-845X.2018.09.008
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双胞胎早产儿视网膜病变与 NDP/ FZD4基因相关分析
叶海昀, 兰小平, 乔彤
通信作者：乔彤（ORCID：0000-0002-3244-4541）,Email：qiaot@shchildren.com.cn

第一作者：叶海昀（ORCID：0000-0002-3420-6539）,Email：yehy@shchildren.com.cn

收稿日期: 2017-03-23
基金资助: 上海市卫计委重要薄弱学科建设项目（2015ZB0203）;上海市儿童医院面上项目（2016YMS001）
摘要

目的 评估及验证中国人双胞胎早产儿视网膜病变（ROP）是否与 NDP和 FZD4基因突变有关。方法 系列病例研究。收集2017年1-12月在上海市儿童医院的6对12例双胞胎ROP 3期患儿,平均胎龄为31周,平均出生体质量为1 252 g,均为出生后4~6周,进行临床及基因检查,通过外周血人基因组DNA提取,采用聚合酶链式反应（PCR）扩增及Sanger测序。结果 12例双胞胎早产儿ROP 3期患儿中6例诊断阈值病变后立即转外院进行光凝联合眼内抗血管内皮生长因子（VEGF）注药治疗,另6例经过门诊密切随访均自行恢复并消退,其中最长随访期达患儿出生后7个月之久。研究中所有患儿的 NDP和 FZD4基因均未检测到明确的致病性点突变或小的序列插入/缺失。结论 未发现双胞胎早产儿ROP与 NDP、 FZD4基因的突变相关,分析可能与其他基因或种族因素相关。

关键词: 双胞胎; 早产儿视网膜病变; NDP基因; FZD4基因
Correlation Analysis between Retinopathy of Prematurity in Twins and the NDP/ FZD4 Gene
Haiyun Ye1, Xiaoping Lan2, Tong Qiao1
1 Department of Ophthalmology, Shanghai Children's Hospital, Children's Hospital of Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200062, China
2 Molecular Diagnostic Laboratory, Shanghai Children's Hospital, Children's Hospital of Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200062, China
Corresponding author:Tong Qiao, Department of Ophthalmology, Shanghai Children's Hospital, Children's Hospital of Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200062, China (Email: qiaot@shchildren.com.cn)
Fund:he Important Weak Discipline Construction Project of Shanghai Municipal Commission of Health and Family Planning (2015ZB0203); Research Project of Shanghai Children's Hospital (2016YMS001)
Abstract

Objective: To evaluate and verify the correlation between retinopathy of prematurity (ROP) in preterm infant Chinese twins with the NDP/ FZD4 gene mutation.Methods: In this case series study, clinical evaluations and gene examinations were done on 12 cases of preterm infant twins (6 couples, aged 4-6 weeks) with ROP which were identified in Shanghai Children's Hospital from January 2017 to December 2017. The mean gestation age was 31 weeks and the mean weight was 1 252 g. Polymerase chain reaction (PCR) amplification and Sanger sequencing were used to extract the human genome DNA from peripheral blood.Results: Twelve premature infants were diagnosed with stage 3 ROP, and 6 infants were diagnosed with threshold ROP disease and treated with photocoagulation combined with an injection of intraocular anti-VEGF medication. Lesions in the other 6 infants subsided during the follow-up period. The longest follow-up period was 7 months after birth. Neither a clear pathogenicity point mutation nor a small insertion/deletion in either a NDP or FZD4 gene was detected in any infants in the study.Conclusions: There was no mutation correlation with the NDP or FZD4 gene in ROP in preterm infant twins. We predicate that other genetic or racial factors cause the ROP in preterm infant twins.

Keyword: twin; retinopathy of prematurity; NDP gene; FZD4 gene

早产儿视网膜病变（Retinopathy of prematurity, ROP）是一种在婴儿时期发生, 因视网膜血管发育不成熟而严重影响视力的疾病[1]。ROP的高危因素包括低出生体质量、低孕周及吸氧史等[2], 除这些外在因素外, 有研究表明ROP的发生与视网膜血管形成相关基因的变异有关, 确切的致病机制目前仍不清楚。已有研究表明部分重症ROP患儿是由frizzled-4（FZD4）和Norrie disease protein （NDP）基因突变所致, 同时FZD4和NDP为家族性渗出性玻璃体视网膜病变（Familial exudative vitreoretinopathy, FEVR）的致病基因, FZD4多为显性遗传, NDP为性连锁遗传[3, 4]。FEVR多发生在足月儿, 多有家族史且为双眼发病, 其临床特征与ROP相似, 均存在视网膜血管的发育不良、视网膜褶皱、视网膜脱离等现象。本研究在对6对双胞胎ROP患儿开展临床检查分析的基础上, 采用Sanger测序法对全血基因组DNA的NDP和FZD4基因的全部外显子编码区及其邻近内含子区进行了测序检测, 以期为预后判断、后续治疗方案的设计及遗传咨询提供依据。

1 对象与方法
1.1 对象

收集2017年1-12月在上海市儿童医院门诊收治的双胞胎ROP患儿共12例（6对）, 男8例, 女4例; 均为剖宫产, 出生胎龄为28~34周, 平均31周。出生体质量为906~1500 g, 平均1 252 g（见表1）。纳入标准：患儿出生后均有吸氧史; 未合并其他器质性病变; 父母非近亲婚配; 双方家族中均无眼底血管疾病或发育不良者; 孕期无用药史或不良环境接触史。本研究遵循赫尔辛基宣言, 经上海市儿童医院伦理委员会（批号：2018R013-E02）批准, 并且所有样本及信息的采集均在监护人知情同意并签署知情同意书的情况后进行。

表1 双胞胎早产儿视网膜病变患儿基本信息 Table 1 Basic information of ROP twins
1.2 ROP的检查方法及诊断标准

符合筛查标准的双胞胎早产儿于出生后4~6周行眼底筛查, 检查前使用复方托吡卡胺滴眼液5 ml进行双眼散瞳, 1次/5 min, 共5次, 同时压迫泪囊, 待瞳孔充分散大后, 0.4%盐酸奥布卡因滴眼液表面麻醉, 使用广域数字眼底检查系统（RetCamⅢ ）检查眼底并保存图像。检查均由同一位眼科医师完成。根据ROP国际分类标准（International classification of retinopathy of prematurity, ICROP）[5]将眼底分为Ⅰ ~Ⅲ 区, 病变程度分为1~5期。退行性病变：早产儿出现ROP改变后未经任何眼科治疗而视网膜病变消退, 周边视网膜血管化; 附加病变：后极部至少2个象限出现视网膜血管扩张、迂曲, 用“ +” 表示附加病变提示活动期病变的严重性。阈值前病变：Ⅰ 区合并附加病变的各期ROP或不伴附加病变的3期病变、Ⅱ 区合并附加病变的2、3期ROP; 阈值病变：处于Ⅰ 区或Ⅱ 区的3期ROP, 新生血管占据连续5个钟点范围, 或病变累计达8个钟点范围, 同时伴有附加病变。对眼底异常患儿, 采用间接眼底镜详细检查病变情况进行确认。检查发现ROP病变但程度未达阈值病变患者, 每2周随访1次; 阈值前病变患儿每周复查1次, 直至ROP病变程度发生改变; 阈值病变患者接受光凝或手术治疗。

1.3 血样采集和 DNA提取

收集患儿乙二胺四乙酸（Ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA）抗凝外周静脉血3~5 ml, 采用QIAamp DNA Blood Mini Kit试剂盒提取基因组DNA, NanoDrop2000微量分光光度计进行DNA浓度定量, 并置-20 ℃冰箱冻存备用。

1.4 Sanger测序

针对NDP和FZD4基因全部编码外显子采用Oligo 7软件设计PCR及测序引物（见表2）进行测序。Sanger测序在3500DX Genetic Analyzer（ABI）上完成, 结果分析采用Mutation Surveyor 4.04软件（美国SoftGenetics公司）进行。

表2 FZD4和NDP基因Sanger测序引物 Tabel 2. FZD4 and NDP gene Sanger sequencing primers
2 结果

研究中6对双胞胎ROP患儿（12例, 24眼）均诊断为ROP 3期, 其中6例患儿确诊阈值病变后, 密切随访, 发现眼底病变加重明显, 立即转外院进行光凝联合眼内抗血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor, VEGF）注药治疗, 另6例ROP患儿在门诊密切随访过程中病变均自行消退, 其中最长随访期达患儿出生后7个月之久。研究中, 患儿的治疗和随访计划均详细告知患儿父母并尊重他们的意愿, 所有患儿父母均否认家族史, 父母视力或矫正视力均> 0.8, 患儿血样本中均未检测到NDP和FZD4基因明确的致病性点突变, 或小序列插入或缺失。

3 讨论

ROP是全球儿童期失明的主要原因之一, 与其发展有关的危险因素包括：小胎龄、低出生体质量、贫血、机械通气（特别是高浓度的补充氧气）、血氧不足、围产期败血症、脑室内出血（Intraventricular hemorrhage, IVH）、体外受精（In vitro fertilization, IVF）以及多胎妊娠等[2]。ROP临床诊断一旦确立, 医师需根据病情进行评估, 决定治疗方案或定期随访复查眼底。临床诊断的ROP 3期患儿中, 部分早产儿的眼底病变能自行消退, 而一些患儿经过治疗后, 却仍进展为晚期ROP, 分析其原因, 可能与ROP遗传易感性相关：Kondo等[3]及Hiraoka等[4]认为视网膜血管形成相关基因的变异与ROP的发生有关, 其中参与影响视网膜发育的4种主要致病基因包括NDP、FZD4、LRP5以及TSPAN12, 这些基因通过连环蛋白介导的视网膜Wnt信号通路影响ROP的进展。

NDP基因位于人染色体 Xp11.4, 基因组全长28 kb, 含3个外显子, 编码Norrin蛋白, FZD4基因位于人染色体11q14.2, 编码frizzled-4受体蛋白。 NDP突变会导致经典Wnt转导途径的信号缺失, 从而扰乱视网膜血管发育。目前, 与NDP相关的关于ROP的文献尚无统一结论, 部分学者[3, 4]在对ROP的研究中发现NPD基因有插入或缺失、错义突变异常的情况。Kim等[6]在对ROP患儿的研究中未能发现NDP基因的相关突变。FZD4 基因决定Wnt配基结合的特异性, Norrin/FZD4蛋白能激活Wnt/β -catenin信号通路, 通过控制转录, 调节内皮细胞生长和视网膜血管发育的过程。Shastry[7]认为部分严重ROP病变可能是FEVR的散发病例合并早产病史, 同时, Rao等[8]指出吸氧史可能是导致FEVR恶化的一个重要因素。故推测, 若患儿同时有基因突变和早产、吸氧等因素存在, 则易形成进展期ROP; 而不含突变基因的早产儿则更倾向于病变自行消退。我们期望能发现与ROP进展相关的异常基因, 通过研究基因突变作用, 有利于准确预测预后发展, 有效指导治疗, 并给ROP患儿家长提供可靠的遗传咨询。本研究入选患儿均为3期ROP, NDP及FZD4相关基因检测结果均为阴性, 由此认为这2个基因的突变检测并不能对ROP的诊断及进展判断起指导作用, 但本研究样本量较小, 基因突变和ROP进展之间的关系尚待进一步的研究证实。

ROP发病与多种因素相关, 可同时存在其他相关致病基因或非基因因素, 其中, 有相关文献陆续报道ROP的发生率及严重程度与种族因素有关, 不同种族的视网膜血管成熟率、平均出生体质量以及孕周不同, 且不同种族眼部色素化程度不同、光照损害程度不同均可影响ROP的诊断[7, 9, 10]。然而, 既往文献多来自欧美人群, 主要涉及白人和黑人早产儿, 亚裔人群相关研究报道甚少。

国内外学者对双胞胎早产儿ROP发生率的观点各异, 且对双胞胎ROP进展风险因素的研究较少。双胞胎早产儿产前因素以及孕龄相同, 区别在于出生体质量和出生后暴露因素。本研究纳入的双胞胎患儿出生体质量对ROP的发展或双胞胎ROP严重程度没有显著影响, 与Woo等[11]的研究一致, 而Azad等[12]的研究指出, 双胞胎中体质量较重的婴儿发生严重ROP的风险更大; Yau等[13]在对双胞胎出生顺序的研究中发现, 双胞胎尽管有相似的出生条件, 但出生后危险因素的易感性存在差异, 与第2个婴儿相比, 第1个出生的婴儿更容易发育不良; 胡晓洁等[14]提出双胞胎早产儿ROP的发生与其是否双胞胎无关, 而与其体质量轻、并发症多和吸氧率高等有关。

综上所述, 目前Norrin/Frizzled-4信号通路介导视网膜血管异常发育的发病过程并不明确, 双胞胎ROP临床表型是否与基因之间存在某种联系尚不可知, 由于本研究样本量有限, 不能得出中国婴儿ROP发病及进展与NDP/FZD4基因突变之间没有遗传关联的结论。尽管研究中未能检测到阳性基因, 依然存在未知的遗传影响因素的可能, 在将来的研究中, 随着中国人FZD4、NDP基因检测遗传问题的深入研究和探索, 双胞胎ROP认识的拓展, 定位新的致病基因, 有利于理解视网膜血管异常发育的分子机制, 对实现基因诊断以及探索新的治疗途径有重要意义。

利益冲突申明 本研究无任何利益冲突

作者贡献声明 叶海昀：收集数据, 参与选题、设计及资料的分析和解释; 撰写论文; 根据编辑部的修改意见进行修改。兰小平：参与设计、资料的分析和解释, 修改论文中关键性结果、结论。乔彤：参与选题、设计和修改论文的结果、结论

The authors have declared that no competing interests exist.

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