不同浓度核黄素-蓝光交联对兔眼巩膜组织生物力学的影响
[邹迎, 张淼, 张丰菊
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引用本文
邹迎, 张淼, 张丰菊. 不同浓度核黄素-蓝光交联对兔眼巩膜组织生物力学的影响[J]. 中华眼视光学与视觉科学杂志, 2017,19(1): 9-13.
ZOU Ying, ZHANG Miao, ZHANG Fengju. Investigation of the biomechanics of blue-light cross-linking on rabbit scleral tissue with different concentrations of riboflavin[J]. CHINESE JOURNAL OF OPTOMETRY OPHTHALMOLOGY AND VISUAL SCIENCE, 2017,19(1): 9-13.
Doi:10.3760/cma.j.issn.1674-845X.2017.01.003
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ZOU Ying, ZHANG Miao, ZHANG Fengju. Investigation of the biomechanics of blue-light cross-linking on rabbit scleral tissue with different concentrations of riboflavin[J]. CHINESE JOURNAL OF OPTOMETRY OPHTHALMOLOGY AND VISUAL SCIENCE, 2017,19(1): 9-13.
Doi:10.3760/cma.j.issn.1674-845X.2017.01.003
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不同浓度核黄素-蓝光交联对兔眼巩膜组织生物力学的影响
摘要
目的 通过使用不同浓度核黄素联合蓝光照射对兔巩膜组织行胶原交联,评估交联后的巩膜生物力学强度,探讨蓝光-核黄素交联法较合理的核黄素浓度。方法 实验研究。选取成年健康新西兰白兔共10只（20眼）。根据随机数字法分为2组,每组5只。均选取右眼为实验眼,左眼为对照眼,2组分别应用0.1%（Ⅰ组）和0.5%（Ⅱ组）核黄素溶液联合460 nm蓝光进行巩膜胶原交联,术后2个月处死动物,取巩膜标本进行单轴拉伸试验,检测应力-应变指标,即杨氏模量、极限应力。采用配对 t检验及独立样本 t检验对数据进行分析。结果 兔眼巩膜的应力-应变曲线呈非线性变化,符合σ=Aexp（B×ε）指数方程,2组实验眼杨氏模量均较对照眼高,差异具有统计学意义（Ⅰ组： t=19.78, P<0.01;Ⅱ组： t=7.82, P<0.01）;类似的,实验眼极限应力也有明显提高,差异具有统计学意义（Ⅰ组： t=4.90, P<0.05;Ⅱ组： t=4.30, P<0.05）;Ⅰ组实验眼杨氏模量较Ⅱ组高,差异具有统计学意义（ t=2.52, P<0.05）;类似的,Ⅰ组实验眼极限应力也较Ⅱ组高,差异具有统计学意义（ t=3.03, P<0.05）。结论 蓝光-核黄素胶原交联法可有效增强兔眼巩膜的生物力学强度,0.1%为核黄素-蓝光交联法较合理的核黄素浓度,能更大限度地增强交联术后巩膜的生物力学强度。
关键词:
胶原交联; 巩膜; 核黄素; 生物力学; 蓝光
doi: 10.3760/cma.j.issn.1674-845X.2017.01.003
Investigation of the biomechanics of blue-light cross-linking on rabbit scleral tissue with different concentrations of riboflavin
Abstract
Objective This study had two objectives: To evaluate the efficiency of collagen cross-linking (CXL) in rabbit sclera induced by different concentrations of riboflavin and blue light.To find the optimal concentration of riboflavin in scleral cross-linking.Methods In this experimental study, scleral stress-strain measurementswere performed to evaluate the biomechanical efficiency of collagen cross-linking using riboflavin and blue light (460 nm). Ten New Zealand rabbits were randomly divided into Group Ⅰ and Ⅱ. In Group Ⅰ, a 0.1% riboflavin solution was used for the CXL induced by blue light. In Group Ⅱ, a 0.5% riboflavin solution was used. In each group, the right eye was defined as the experimental eye and the left eye was the control. Biomechanical measurements of scleral strips were performed 2 months after CXL using a microcomputer-controlled biomaterial testing device. The focus was on Young′s modulus calculated as σ=Aexp(B×ε) and maximum stress. The data were analyzed by paired sample t-test and two independent sample t-test.Results Scleral specimens from both groups exhibited nonlinear stress-strain behavior with an initially low Young′s modulus that increased gradually under higher stress. It was derived using the equation σ=Aexp(B×ε). The Young′s modulus (Group Ⅰ: t=19.78, P<0.01; Group Ⅱ: t=7.82, P<0.01) and maximum stress (Group Ⅰ: t=4.90, P<0.05; Group Ⅱ: t=4.30, P<0.05) of the sclera increased after CXL. In addition, the scleral strips in Group Ⅰ were stiffer than in Group Ⅱ (Young′s modulus: t=2.52, P<0.05; Maximum stress: t=3.03, P<0.05).Conclusion CXL induced by riboflavin/blue light can significantly enhance the biomechanical strength of rabbit sclera. The 0.1% riboflavin solution had significantly better biomechanical behavior than the 0.5% riboflavin in CXL.
Keyword:
Collagen cross-linking; Sclera; Riboflavin; Biomechanics; Blue light
胶原交联法是指交联物质在特定的条件下被激活, 产生氧自由基或者单态氧, 从而诱导胶原纤维之间共价键的形成, 以此来增加胶原纤维共价键的密度, 提高组织对蛋白水解酶的耐受性。分为物理交联法和化学交联法, 物理交联法中以紫外光核黄素交联技术最为成熟。
Wollensak等学者[1, 2, 3]自2004年起就一直致力于紫外光-核黄素巩膜交联法的研究, 分别在尸体眼、活体兔眼进行巩膜胶原交联, 证实了交联法的长期有效性和安全性。但另有国内学者从视网膜功能和细胞的凋亡两方面着手, 采用视网膜电流图、TUNEL染色技术和透射电镜技术对巩膜紫外光-核黄素胶原交联术在兔眼的安全性进行研究, 发现巩膜交联术会对视网膜细胞的结构和功能造成损伤, 证实了国际上常用的巩膜紫外光-核黄素胶原交联方案并不安全[4]。
Speorl等[5]已发现, 核黄素存在3个光波的吸收峰, 即460 nm蓝光、370 nm紫外光和小于300 nm的紫外光。其中小于300 nm的紫外光由于具有潜在导致DNA突变的作用而不能用于临床。理论上来说蓝光较紫外光有更好的有效性及安全性[6]。
因为紫外光/蓝光-核黄素交联术中, 光敏剂核黄素充当着“ 交联剂” 、“ 保护剂” 、“ 润滑剂” 的作用[7], 所以明确核黄素在眼内组织的弥散过程及饱和终点对交联术的安全性方面意义重大。张学敏等[8]采用双光子显微镜观察不同浸润时间、不同浓度对巩膜组织的渗透情况, 即0.1%和0.5%巩膜胶原交联法中应用的2个经典核黄素浓度, 发现核黄素浸润约20 min后, 在人尸体眼和兔眼巩膜组织内均能达到饱和, 且0.5%的核黄素浸润能够使兔眼巩膜内核黄素含量达到较高水平。
在紫外光或蓝光核黄素交联法的各项研究中, 对于核黄素浓度的选择不尽相同[1, 3, 9], 目前存在0.1%和0.5% 2个主流的浓度, 哪种浓度更加合理?是否核黄素浓度越高, 交联效果就越好呢?这个问题目前尚未阐明。因此, 本研究旨在探讨不同浓度核黄素-蓝光交联对兔眼巩膜组织生物力学的影响, 以期指导巩膜蓝光-核黄素交联法在临床的应用。
1 材料与方法
1.1 实验对象
由首都医科大学实验动物中心提供的清洁级新西兰白兔10只, 雌雄不限, 体质量2.0~2.5 kg, 为了排除干扰实验结果的常见眼科疾病, 实验前对每只实验兔均进行了常规眼科检查, 包括眼前节检查和眼后节检查。根据SPSS随机数字生成器将这些动物随机分为2组, 分别为Ⅰ 组（浸润0.1%核黄素溶液组）、Ⅱ 组（浸润0.5%核黄素溶液组）, 每组5只, 其中右眼作为实验眼, 左眼作为对照眼。实验过程中动物使用符合美国眼科和视觉研究协会关于动物使用宣言的规定。
1.2 实验方法
1.2.1 术前准备 交联前1 d实验动物眼点妥布霉素滴眼液6次。
1.2.2 动物麻醉 对实验动物耳缘静脉注射5%戊巴比妥钠（5 mg/kg）施行麻醉, 使其完全麻醉。
1.2.3 手术方法 将实验兔置于手术台上, 右眼向上, 常规消毒铺巾, 开睑器开睑。剪开鼻上方结膜, 打开筋膜囊, 斜视钩分离上直肌和内直肌, 并做上直肌和内直肌5-0牵引线, 充分暴露鼻上象限赤道部巩膜, 区域需> 10 mm2（见图1）。2组分别在暴露的巩膜区域上滴0.1%或0.5%的核黄素溶液, 每分钟滴1次, 保持巩膜湿润及保持相应的核黄素浓度, 浸润20 min。蓝光辐照度为26 mw/cm2, 蓝光垂直于巩膜交联区域, 辐照距离为40 mm, 交联区域10 mm2, 持续20 min, 照射过程中每分钟点1次核黄素溶液, 持续20 min。术毕妥布霉素滴眼液冲洗结膜囊, 滴用盐酸爱尔卡因滴眼液, 观察实验动物至清醒后送回动物房。各组实验动物均在其右眼施行巩膜胶原交联术, 左眼施行假手术。假手术方法除不采用蓝光治疗仪照射手术区域的巩膜外, 其余步骤与右眼相同。
 | 图1 兔眼巩膜胶原交联部位的模式图Figure 1 Schematic elevation views of a rabbit eyeball showing the scleral collagen cross-linking locations. |
1.2.4 力学检测 交联术后2个月, 在耳缘静脉内给予致死量的戊巴比妥钠注射液处死实验动物后, 进行手术。分离眼球周围的结膜、筋膜及肌肉组织, 离断视神经, 取出眼球。将眼球内容物如晶状体、玻璃体、视网膜及脉络膜一并清理干净, 确定交联部位, 用自制的三刃刀沿眼球前后径方向切取2 mm× 14 mm大小的条形巩膜试件。先将巩膜试件放在激光位移传感器上测量厚度。将巩膜条带垂直夹在动态疲劳拉伸压缩材料试验机上下两端的夹具上, 用机械游标卡尺对准2个夹持器边缘, 微调使夹具之间的长度为10 mm时夹紧下方夹具。巩膜条带预拉伸试验：测试前对试件进行预拉伸试验, 即在同一应力水平下加载-卸载多次, 直至应力-应变曲线趋于稳定。预实验结束后以1 mm/min的加载速度逐渐增加负荷, 直至该巩膜试件拉伸至断裂（见图2）。实验进行过程中, 与材料性能试验机相连的计算机自动记录有关数据和应力-应变曲线。然后用SPSS计算程序对计算机记录的应力、应变实验数据以指数函数σ =Aexp（B× ε ）进行拟合, 得出应力-应变拟合曲线, 并计算出杨氏模量、极限应力。本研究取当应变量为8%时对应的各试件的杨氏模量和极限应力数据进行分析。
 | 图2 夹持巩膜条带的生物力学测试仪Figure 2 Biomaterial testing machine with a scleral strip between the clamps. |
如何尽量避免力学试验的误差：根据生物力学原理, 只有当试件长宽比接近5∶ 1时才能忽略拉伸过程中生物试件发生“ 颈缩” 的影响, 若在试件拉伸过程中, 出现此现象, 则说明材料经过了从弹性变形到塑性变形的阶段。为避免此现象的发生, 本研究中所切取的条形巩膜试件大小为2 mm× 14 mm, 从而尽可能地减少巩膜本身的垂直于拉伸方向的弹性回缩对拉伸试验准确性的干扰。拉伸过程中, 弃去夹持器松动致使巩膜试件从夹持器中被拉出来的样本, 去掉拉伸早期阶段就发现试件边上出现小裂痕的样本（很可能为制作试样时刀具停顿造成的）。数据处理过程中注意去掉预拉伸阶段应力应变阶段无序和载荷在零值附近的数据。
1.3 统计学方法
实验研究。采用SPSS 19.0软件对数据进行分析。实验结果中杨氏模量、应力均为定量资料, 利用单样本Kolmogorov-Smirnov检验来检验数据的正态性, 如符合正态分布, 数据以x± s表示。利用Levene检验来检验数据的方差齐性。利用配对t检验比较实验动物左、右眼的巩膜生物力学强度。利用独立样本t检验比较2组间的巩膜生物力学强度。以P< 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
兔眼巩膜的应力-应变曲线呈非线性变化, 符合σ =Aexp（B× ε ）指数方程。
当应变量为8%时, Ⅰ 组右眼、左眼的杨氏模量分别为（12.10± 1.81）MPa、（4.55± 0.56）MPa, 右眼较左眼高, 差异具有统计学意义（t=19.78, P< 0.01）。Ⅱ 组右眼、左眼的杨氏模量分别为（8.43± 1.15）MPa、（4.71± 0.72）MPa, 右眼较左眼高, 差异具有统计学意义（t=7.82, P< 0.01）。Ⅰ 组实验眼的杨氏模量较Ⅱ 组高, 差异具有统计学意义（t=2.52, P< 0.05）。
当应变量为8%时, Ⅰ 组右眼、左眼的极限应力分别为（5.57± 1.63）MPa、（2.18± 0.73）MPa, 右眼较左眼高, 差异具有统计学意义（t=4.90, P< 0.05）。Ⅱ 组右眼、左眼的极限应力分别为（3.57± 0.65）MPa、（1.92± 0.45）MPa, 右眼较左眼高, 差异具有统计学意义（t=4.30, P< 0.05）。Ⅰ 组实验眼的极限应力较Ⅱ 组大, 差异具有统计学意义（t=3.03, P< 0.05）。
3 讨论
近视是全球高发性的眼病, 我国尤甚, 在大学生中患病率甚至超过70%[10]。近视分为单纯性近视和病理性近视, 其中病理性近视对视力危害最大, 病理性近视致盲已成为我国致盲的主要原因之一, 是低视力的首要因素。其重要特征之一是进行性眼轴变长, 随之巩膜生物力学减弱、组织逐渐变薄而发生眼底病理性改变导致盲。病理性近视的原因可能是视觉剥夺后正视化的反馈机制紊乱, 或者是巩膜组织的代谢异常等。但是其均可导致巩膜结构异常例如胶原纤维直径减少和纤维增生紊乱而引起巩膜、视网膜、脉络膜组织的延长和变薄。
目前临床上有几种手术修复巩膜的方法如在后巩膜部Tenon′ s囊下注射多聚物以及后巩膜加固术等[11, 12]。且这些方法延缓高度近视眼轴增长的长期术后效果已得到了肯定[13]。但是上述这些方法并不能使巩膜的内层结构获得再生和联结。巩膜胶原交联法的出现弥补了这一缺憾。
我们研究发现0.1%的核黄素蓝光胶原交联相较0.5%更为有效, 考虑原因可能为核黄素分子阻挡了蓝光的继续射入[14], 进而阻挡了深层的巩膜胶原交联, Ⅱ 组与Ⅰ 组相比, 巩膜表面初始的浓度相对高, 蓝光被阻挡较多, 因此深层的巩膜组织就得不到交联, 所以并非浓度越高, 交联效果越好。
巩膜是由不同直径的胶原纤维交织成胶原纤维束, 在赤道部和后极部主要是由Ⅰ 型和Ⅲ 型胶原纤维组成[15], 用核磁共振研究巩膜胶原纤维交联的数量[3], 证实了在近视眼中, 后极部巩膜的胶原纤维交联数量减少约12%, 而赤道部数量减少约15%, 这就说明了近视眼中, 对赤道部巩膜交联特性的改变程度较明显。Curtin等[11]研究发现巩膜区域性的变化不仅是由于巩膜的厚度不同, 也由于巩膜胶原纤维束的直径大小、紧密程度和纤维束间夹角的不同而造成的。已有研究发现, 在进行性近视发病的初期主要是赤道部巩膜发生变形, 直到终末期后极部巩膜才发生明显的变形[12], 所以进行赤道部巩膜胶原交联对进行性近视的早期防治有积极意义。而一旦在近视发展过程中后极部巩膜出现了局部变薄和扩张时, 这时巩膜厚度变薄, 无法准确评估巩膜厚度, 以往胶原交联方案若是照搬在手术中, 则可能会造成巩膜后方视网膜和脉络膜的损伤, 进而使本身就已损害的视功能进一步受损, 而且要注意避开黄斑部位, 所以后极部巩膜交联是不被推荐的。Geraghty等[16]研究了不同区域人巩膜的生物特性与年龄的相关性, 结果发现年龄每增长10年, 赤道部和后极部巩膜的力学强度分别增长2.1 MPa（4.8%）和0.3 MPa（0.6%）, 以上的研究结果都说明了赤道部巩膜对于胶原变化更为敏感。另有国内学者[17]研究发现紫外线核黄素胶原交联对尸体眼赤道部巩膜生物力学增强的效果比后极部巩膜更为明显。而且若在临床应用, 在巩膜后极部进行操作的难度比较大, 对眼球牵拉力度大, 必将对患者造成更明显的不适, 例如眼心反射。而且后极部又靠近黄斑, 所以危险性也比较大。所以本课题组认为赤道部巩膜是巩膜胶原交联较好的位置选择。
借鉴于Wollensak和Iomdina[3]改进了实验操作方法, 将配置核黄素溶液的溶剂由右旋糖酐换为0.9%氯化钠溶液, 以确保交联部位巩膜能更充分地与核黄素结合。虽然右旋糖酐的保湿效果明显优于0.9%氯化钠溶液, 但是却可能降低了溶质在交联区域的渗透, 若溶剂为0.9%氯化钠溶液, 虽然核黄素溶液蒸发得快, 但也可以使核黄素更快地渗透, 以便得到更好的交联效果。
2004年, Wollenk和Spoerl[1]首次开展巩膜组织的紫外光-核黄素交联, 实验中对暴露的巩膜组织给予0.1%的核黄素溶液预浸润10 min。2008年, Iseli等[9]开展了巩膜组织的蓝光-核黄素交联, 采用0.5%的核黄素溶液预浸润20 min。另外, 也有研究采用的预浸润时间为5 min[18]、15 min[19]。对于核黄素预浸润时间, 目前还没有明确的标准, 王萌萌等[17]对浸润不同时间核黄素的巩膜组织在胶原交联后行生物力学检测, 发现20 min后各组生物力学无差异。综上所述, 本研究核黄素浸润时间选取20 min, 考虑到该方法将进一步应用到临床实践中, 手术操作时间在不影响效果前提下越短越好。
目前尚存在的问题：本研究的实验对象是新西兰白兔, 众所周知, 人眼与兔眼存在很大差异。人眼巩膜赤道部厚度为（0.40± 0.15）mm[1], 兔眼为（0.39± 0.11）mm[3], 人眼巩膜相对更厚, 会影响药物的渗透性[20], 此外, 兔眼比人眼体积小、兔眼色素膜血流更快以致增加药物的清除[21]等均可能使药物在兔眼巩膜内的核黄素浓度与人眼不同。为了更好地验证该结论, 以期指导蓝光-核黄素胶原交联法应用于临床, 可进一步采用灵长类动物为实验对象。本课题组目前正在进行相关的深入研究。
综上, 蓝光-核黄素巩膜胶原交联法能够有效地提高兔眼巩膜的生物力学强度, 0.1%为核黄素-蓝光交联法中较合理的核黄素浓度, 相比0.5%的核黄素浓度能更大限度地提高交联术后巩膜的生物力学强度。此结论对于指导巩膜组织的蓝光-核黄素交联法中核黄素的浓度应用有一定的意义, 为临床应用提供参考依据。但是蓝光-核黄素巩膜胶原交联法对于眼内组织的安全性及长期的有效性还有待进一步的观察。
利益冲突申明 本研究无任何利益冲突
作者贡献声明 邹迎、张淼：负责收集数据, 实施实验及资料的分析和解释; 撰写论文; 修改论文。张丰菊：负责课题选题、设计及资料的分析和解释, 对编辑部的修改意见进行核修
The authors have declared that no competing interests exist.
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