1.1.1 试剂 溶菌酶（美国Sigma公司）、BSA（白蛋白, 美国Sigma公司）、γ -Globulin（γ -球蛋白, 美国Sigma公司）、NaCl、CaCl₂· 2H₂O、Na₂HPO₄· 12H₂O、NaH₂PO₄· 2H₂O、去离子水、HCl、NaOH、戊二醛、乙醇。

1.1.2 受试镜片 IV类镜片：软性亲水接触镜（型号：55MB）, 海昌隐形眼镜有限公司, 注册证编号：国食药监械（准）字2012第3220492号, 镜片材料为Ocufilcon D, 含水量：55% ± 2%, DK：19.7× 10^-11 （cm²/s） （mlO₂/ml· mmHg） ± 20%, 批号：G1305912。

1.1.3 试验用护理液 ①护理液1：隐形眼镜护理液（型号：AIO）, 江苏中润光学眼镜有限公司, 注册证编号：国械注准20153222322, 生产批号：H140113, 规格：100 ml。②护理液2：隐形眼镜护理液（型号：修复多功能型）, 上海卫康光学眼镜有限公司, 注册证编号：国食药监械（准）字2012第3220731号, 生产批号：XFMD15B, 规格：355 ml。此2种护理液说明书上注明具有除蛋白功能。

1.1.4 仪器与设备 PHSJ-4F数显pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司）; LRH-250F生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）; 自动临界点干燥仪（LEICA EM CPD300）; 刻蚀镀膜仪（BAL-TEC Sputter Coater, SCD500）; S-4800场发射扫描电子显微镜（Model S-4800 field emission scanning electron microscope, 日本日立公司）。

1.2.1 溶液的配制 ①人工泪液的配制：参考刘毅等^[18]的研究进行实验用人工泪液的配制：溶菌酶1.9 mg/ml, BSA 0.2 mg/ml, γ -Globulin 0.1 mg/ml, Na₂HPO₄· 12H₂O 0.14 mg/ml, CaCl₂· 2H₂O 0.25 mg/ml, NaCl 0.5 mg/ml。用去离子水溶解上述各溶质, 最后用NaOH或HCl调节pH值为7.4 ± 0.2。根据每次所需用量配制, 一次性使用。（2）PBS的配制：NaCl 8.3 g, NaH₂PO₄· 2H₂O 0.528 g, Na₂HPO₄· 12H₂O 5.993 g; 将3种化合物依次加入到700 ml容量的纯化水中, 搅拌确保所有溶质充分溶解, 用酸或碱调整pH值为7.4 ± 0.1, 然后再加纯化水稀释到1 000 ml, 充分混合后再测试pH, 若需要再加酸或碱调整。

1.2.2 镜片上蛋白的吸附 依据刘毅等^[18]的研究在7 ml具塞小瓶中加入5 ml人工泪液, 然后将未使用的镜片浸泡于人工泪液中, 35℃ ± 1℃培养65 h。

1.2.3 镜片上蛋白清除 未揉搓组：将吸附蛋白后的镜片取出, 然后分别用PBS、护理液1和护理液2冲洗镜片正反面, 处理后的镜片再浸泡在对应的PBS、护理液1和护理液2中, 浸泡6 h。

揉搓组：将吸附蛋白后的镜片取出并对折, 放在戴着乳胶指套的拇指和食指间轻揉20次, 然后分别用PBS、护理液1和护理液2冲洗镜片正反面, 处理后的镜片再浸泡在对应的PBS、护理液1和护理液2中, 浸泡6 h。

未使用过的镜片作为阴性对照。吸附蛋白后且未经PBS或护理液处理的镜片作为阳性对照。分别进行3次平行试验。

1.2.4 扫描电镜（SEM）观察 将以上镜片在2.5%的戊二醛溶液中固定30 min以上, 依次用20%、40%、60%、80%和95%的乙醇溶液梯度脱水处理15 min, 再用100%的乙醇处理2次, 每次20 min。临界点干燥后喷金镀膜, 扫描电镜下观察镜片表面特征并拍摄。扫描电镜观察时先进行100倍的宽视野观察, 找到具有代表性（有较多蛋白碎片团聚）区域后再将放大倍数调为1 500倍, 固定亮度和对比度, 每片镜片选取3个蛋白碎片最多的点进行观察。

实验研究。采用GraySeg-ment、Excel和SPSS 17.0软件对数据进行分析处理, 试验数据进行单因素方差分析, 多重比较采用Tukey法。

利用计算机视觉领域中的图像处理技术即GraySegment软件, 对SEM图像的灰度/亮度划分等级, 并统计相应等级所包含的面积, 其中不同的灰度等级以及不同灰度等级对应的面积反映了镜片表面扫描电镜后蛋白残留量的大小。

本试验图像中, 最小灰度为0, 最大灰度为255。图像处理时, 首先设定5个梯度等级的灰度阈值, 并以灰度值100为最小阈值, 按梯度逐渐增大阈值; 然后利用全局阈值分割法提取SEM图像的不同灰度区域, 即分割提取出每2个灰度阈值之间的图像像素; 最后统计这些像素所组成的不同区域的面积。其中, 亮度越大, 面积越大, 表示蛋白越多, 反之亦然。

蛋白清除率的计算公式如下：

蛋白质在软性亲水接触镜上的沉积与镜片材料所含的化学基团特别是亲水性离子型基团有关^{[19, 20, 21]}。材料中离子型基团摩尔数越高, 材料与蛋白之间静电作用力越强, 进而吸附的蛋白越多。离子型材料比非离子型材料与蛋白大分子间的范德华作用力大得多, 在相同含水量的情况下, 离子型材料对蛋白的吸附量远高于非离子材料对蛋白的吸附量^{[19, 20, 21]}。美国FDA将软性亲水接触镜材料分为4类, “ IV” 类为离子型高含水镜片。选用“ IV” 类镜片作为受试样品, 是由于该类镜片材料所含的离子基团数量最多, 吸附蛋白量最大, 具有吸附极大化的代表性。

考虑到试验图片较多, 因此举例1组试验图片（见图1）。由图1可以看出, 全新的IV类镜片（见图1A）表面干净、整洁, 几乎无白色颗粒。吸附人工泪液蛋白后的镜片（见图1B）存在大量片状蛋白、杆菌和球菌。分别经PBS、2种护理液处理后的镜片表面（见图1C-E）的蛋白颗粒数量显著降低; 尤其经护理液揉搓、冲洗、浸泡后, 图1D、图1E示镜片表面的大部分蛋白碎片已被清除。该结果表明, 护理液能够明显清除镜片表面的蛋白, 从而有效地避免了镜片表面大量的蛋白沉积对配戴者的影响。

图1.

Figure 1.

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图1. 100倍数下的IV类软性角膜接触镜片电镜扫描照片 A：全新镜片（阴性对照）; B：吸附人工泪液后的镜片（阳性对照）; C：经PBS处理后的镜片; D：经护理液1处理后的镜片; E：经护理液2处理后的镜片Figure 1. SEM of soft contact lenses magnified 100 times. A: A new lens (negative control); B: Lens after absorption of artificial tears (positive control); C: Lens after treatment with PBS; D: Lens after treatment with contact lens care solution 1; E: Lens after treatment with contact lens care solution 2. SEM, scanning electron microscopy.

通过图2可以更直观地观察到不同处理下的镜片表面的特征, 其中吸附人工泪液的镜片表面（见图2B）中可以看到大量的网状蛋白, 经PBS处理后的镜片表面（见图2C）中仍明显地存在一些聚集片状的蛋白, 而分别经2种护理液处理后的镜片表面中只剩余为数不多的点状蛋白（见图2D-E）。

图2.

Figure 2.

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图2. 1 500倍数下的IV类软性角膜接触镜片电镜扫描照片 A：全新镜片（阴性对照）; B：吸附人工泪液后的镜片（阳性对照）; C：经PBS处理后的镜片; D：经护理液1处理后的镜片; E：经护理液2处理后的镜片Figure 2. SEM of soft contact lenses magnified 1 500 times. A: A new lens (negative control); B: Lens after absorption of artificial tears (positive control); C: Lens after treatment with PBS; D: Lens after treatment with lens care solution 1. E: Lens after treatment with lens care solution 2. SEM, scanning electron microscopy.

分别对图1中100倍和图2中1 500倍下的镜片表面的SEM照片进行计算机图像处理, 不同护理产品对IV类镜片表面蛋白残留量的影响如表1所示, 从表中数据可以看出, PBS或不同种类的护理液直接影响镜片表面蛋白的残留量。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 不同护理产品对IV类软性角膜接触镜片表面蛋白残留量的影响 Table 1 Effect of different care products on the protein residual amount of IV class lenses Parallel test 100 × magnification (%) 1 500 × magnification (%) test I test II test III test I test II test III Negative control 70.004 00.0010 000.003 00.003 00.001 00.001 Positive control 73.432 60.6500 063.170 74.269 80.118 78.808 PBS Not rub 11.650 9.050 10.680 14.173 16.880 16.460 Rub 10.404 5.020 05.580 07.665 08.173 08.035 Care solution 1 Not rub 17.800 3.210 05.170 08.320 14.130 11.320 Rub 11.596 0.940 01.100 00.284 01.930 01.530 Care solution 2 Not rub 16.680 4.800 06.130 09.560 13.650 12.980 Rub 10.285 0.650 02.150 00.199 02.310 01.610 The percentages in the table are the percentages of the SEM photo area occupied by the areas in the region among 100-255 gray scale thresholds.

表1 不同护理产品对IV类软性角膜接触镜片表面蛋白残留量的影响 Table 1 Effect of different care products on the protein residual amount of IV class lenses

放大倍数为100时, 其中阴性对照组（全新镜片）中阳性率占0.001%~0.004%, 可能由于镜片表面存在无机盐或杂质等干扰所致; 吸附蛋白后的阳性对照组镜片表面蛋白总量为60.650%~73.432%; 镜片分别经过PBS和护理液1揉搓20次、冲洗、浸泡6 h后的镜片表面蛋白残留量为5.020%~10.404%和0.940%~1.596%, 护理液2揉搓、冲洗、浸泡后的镜片表面蛋白残留总量为0.285%~2.150%。从以上统计数据可得到镜片表面残留蛋白数量的趋势：PBS处理后镜片表面所残留的蛋白数量多于具有除蛋白功能护理液, 未经揉搓处理的镜片表面所残留的蛋白数量多于经揉搓处理的镜片表面所残留的蛋白数量。

放大倍数为1 500时, 从图中可以更明显地观察到不同护理产品对镜片上蛋白残留量的影响。其中阴性对照组（全新镜片）几乎无蛋白残留, 阳性对照组蛋白占到74.269%~80.118%, 经PBS和护理液1揉搓、冲洗、浸泡后镜片表面蛋白量分别为7.665%~8.173%和0.284%~1.930%, 护理液2处理后的蛋白量为0.199%~2.130%。具体数据详见表1。

通过表1中数据来计算蛋白清除率, 如表2所示。从计算结果可以看出, PBS和不同种类的护理液能够不同程度地清除镜片表面的蛋白。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 不同护理产品对IV类软性角膜接触镜片表面蛋白清除率的影响 Table 2 Effect of different care products on the removing protein for IV class lenses Groups 100 × magnification (%) 1 500 × magnification (%) PBS Not rub 84.11 ± 0.99 79.66 ± 1.10 Rub 89.58 ± 3.25a 89.76 ± 0.07a Care solution 1 Not rub 91.97 ± 2.67 85.60 ± 3.22 Rub 98.18 ± 0.32ab 98.42 ± 1.06ab Care solution 2 Not rub 91.10 ± 0.91 84.54 ± 2.26 Rub 98.38 ± 1.58ab 98.27 ± 1.34ab Paralled tests for 3 times. Compare with not rub, aP < 0.05; Compare with PBS, bP < 0.05.

表2 不同护理产品对IV类软性角膜接触镜片表面蛋白清除率的影响 Table 2 Effect of different care products on the removing protein for IV class lenses

放大倍数为100倍和1 500倍时, 未经揉搓处理组和揉搓处理组的蛋白清除率存在显著性差异, 其中经揉搓处理后镜片的蛋白清除率显著性提高, 表明“ 揉搓” 操作明显有利于镜片表面蛋白的去除。再者, 揉搓组中经PBS和护理液处理后的镜片蛋白清除率不同, 其中护理液组蛋白清除率显著高于PBS组（均P< 0.05）, 而护理液1组和护理液2组的之间差异无统计学意义, 其蛋白清除率相接近, 护理液1和护理液2组“ 揉搓” 操作后100倍时蛋白清除率分别为98.18%和98.38%, 1 500倍时分别为98.42%和98.27%。由此可见, 护理液浸泡并结合“ 揉搓” 处理对镜片表面的蛋白清除效果最明显。