患者, 男, 26岁, 因“ 双眼自幼视力差” 于2014年7月8日至北京协和医院眼科门诊就诊。患者自幼双眼视力差, 6岁时就诊于当地医院眼科, 眼部检查发现双眼眼球水平震颤, 眼底检查提示双眼视盘色淡, 视网膜呈橘红色, 诊断为“ 双眼先天性视神经发育不良” 。同年患者至上级医院眼科就诊, 眼科查体示双眼视远时眼球震颤明显, 前节及晶状体无异常, 眼底呈豹纹状, 色偏红。眼位检查：角膜映光法：视近正位; 视远交替性外斜约15° ; 交替遮盖试验：双眼由外向中运动。阿托品散瞳验光：右眼+0.50+1.00× 90, 左眼+3.00× 90, 双眼最佳矫正视力（BCVA）均为0.3。诊断为“ 双眼屈光不正, 双眼弱视, 双眼间歇性外斜视, 双眼隐性眼球震颤” 。之后坚持配戴眼镜、遮盖治疗及弱视训练, 视力长期稳定但也无明显提高。患者13岁时曾于外院检查发现双眼角膜中央区呈斑点状灰白色混浊, 诊断为“ 双眼角膜变性” , 此后未定期随诊。5年前患者开始觉察双眼视力呈缓慢进行性下降, 为进一步诊治至我院眼科门诊就诊。既往史：采血或磕碰后皮肤常出现严重瘀斑。家族史：父母是表兄妹, 为近亲结婚（见图1）。全身检查：毛发棕黄色, 皮肤白皙, 余无明显异常。眼科检查：视力：右眼0.1, 左眼0.12; 双眼水平钟摆样震颤, 结膜无充血, 中央区角膜上皮下斑块状混浊, 前房深度正常, 虹膜呈浅褐色（见图2）, 晶状体透明, 瞳孔对光反射灵敏; 散瞳后由间接眼底镜检查眼底, 隐见双眼视网膜色红, 因角膜混浊遮挡, 眼底细节不清晰（见图3）。初步诊断：①Hermansky-Pudlak综合征（HPS）; ②双眼角膜营养不良。为确诊, 进一步检查结果显示如下：前节光学相干断层扫描（OCT）检查显示双眼角膜上皮下基质斑块状高信号影（见图4）; 血常规及胸部X光检查未见异常。

图1

Figure 1

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	图1 同时患Hermansky-Pudlak综合征3型和斑块状角膜营养不良男性青年家系图。█患病男性, □正常男性, ○正常女性, /已故, ↗先证者Figure 1 Pedigree of the adolescent male suffering from Hermansky-Pudlak syndrome and macular corneal dystrophy.█affected male, □unaffected male, ○unaffected female, /deceased individuals, ↗proband.

图2

Figure 2

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	图2 同时患Hermansky-Pudlak综合征3型和斑块状角膜营养不良男性青年眼前节照相：双眼中央区角膜上皮下及基质内灰白色斑块状混浊。A：右眼; B：左眼Figure 2 Anterior segment photographs of the adolescent male suffering from Hermansky-Pudlak syndrome and macular corneal dystrophy. Grey plaque-like opacities were present in the corneal subepithelial stroma of both eyes. A: right eye; B: left eye.

图3

Figure 3

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	图3 同时患Hermansky-Pudlak综合征3型和斑块状角膜营养不良男性青年眼底彩照：双眼眼底模糊, 隐见视网膜色红。A：右眼; B：左眼Figure 3 Fundus photographs of the adolescent male suffering from Hermansky-Pudlak syndrome and macular corneal dystrophy. The fundus pictures of both eyes were blurred and hypopigmentation was present. A: right eye; B: left eye.

图4

Figure 4

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	图4 同时患Hermansky-Pudlak综合征3型和斑块状角膜营养不良男性青年前节OCT：双眼角膜上皮下及基质斑块状高信号影。A：右眼; B：左眼Figure 4 Anterior segment optical coherence tomography (OCT) of the adolescent male suffering from Hermansky-Pudlak syndrome and macular corneal dystrophy. A high reflectivity lesion was present in the corneal subepithelial stroma of both eyes. A: right eye; B: left eye.

采集患者及父母3人外周静脉血, QIAamp DNA Blood Midi试剂盒法提取全基因组DNA。将患者基因组DNA随机片段化成为200~500 bp片段; 对片段进行末端修复、腺嘌呤末端延伸及接头连接并通过PCR扩增使文库富集。使用Nimblegen基因捕获探针对DNA文库中的目的基因进行捕获, 该捕获探针覆盖55个基因, 包括目前已知的与角膜营养不良相关的27个基因及与白化病相关的28个基因（探针基因列表见表1）; 通过PCR扩增捕获产物。使用Illumina Hiseq X-ten高通量测序仪进行测序。测序数据与UCSC数据库中人类基因组参考序列hg19进行比对并对目标区域的覆盖度和测序质量进行评估, 与1000 Genomes及dbSNP等数据库进行比对以确定是否为SNP, 与人类基因突变数据库（HGMD）进行比对, 判断是否为已报道突变; 应用Polyphen2、SIFT及MutationTaster对新发现的错义突变进行致病性预测。对可疑致病突变进行Sanger测序, 并对父母亲进行验证^[1]。发现患者携带HPS3基因c.1868_1872delATGAA纯合突变和CHST6基因c.530G> C（p.R177P）纯合突变, 父母双方均为致病突变携带者（见图5）。最终诊断：①Hermansky-Pudlak综合征3型; ②双眼斑块状角膜营养不良（Macular corneal dystrophy, MCD）。

图5

Figure 5

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图5 同时患Hermansky-Pudlak综合征和斑块状角膜营养不良男性青年HPS3和CHST6基因测序结果 A：患者HPS3基因存在c.1868_1872delATGAA纯合突变, 父母为杂合携带者; B：患者CHST6基因存在c.530G> C（p.R177P）纯合突变, 父母为杂合携带者Figure 5 Chromatograms of HPS3 and CHST6 genes of the adolescent male suffering from Hermansky-Pudlak syndrome and macular corneal dystrophy. A mutation in the HPS3 gene （c. 1868_1872delATGAA） （A） and a mutation in the CHST6 gene （c.530G> C） （B） were identified in the patient.

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 角膜营养不良、白化病及相关疾病有关的基因 Table 1 Genes associated with corneal dystrophy, albinism, and related diseases Disease Associated Genes Corneal dystrophy AGBL1, CHST6, COL8A2, CYP4V2, FAH, GSN, HPD, HPD, KRT3, LCAT, LOXHD1, LUM, PIKFYVE, SLC4A11, STS, TACSTD2, TAT, TCF4, TGFBI, UBIAD1, VSX1, ZEB1, DCN, MBTPS2, CHRDL1, OSMR, GLA Albinism and related diseases AP3B1, ASIP, BLOC1S3, BLOC1S6, C10orf11, DTNBP1, FRMD7, GPR143, HPS1, HPS3, HPS4, HPS5, HPS6, IRF4, LAMTOR2, LYST, MATP, MC1R, MLPH, MYO5A, OCA2, RAB27A, SLC24A4, SLC24A5, SLC45A2, TPCN2, TYR, TYRP1

表1 角膜营养不良、白化病及相关疾病有关的基因 Table 1 Genes associated with corneal dystrophy, albinism, and related diseases

讨论：本例患者为青年男性, 自幼视力差, 眼部及全身体征提示眼皮肤白化病, 追问病史, 有磕碰后瘀斑等出血倾向, 符合HPS的临床特征。另外患者近5年视力呈进行性下降, 眼部检查发现角膜上皮下基质斑块状混浊, 近期视力下降可能与角膜营养不良有关。基因检测发现患者HPS3基因和CHST6基因的纯合突变, 确诊为HPS3型及MCD。本例患者同时患有上述2种罕见的眼部常染色体隐性遗传病, 目前国内外文献尚无报道。

HPS是白化病综合征的一种, 为常染色体隐性遗传, 由Hermanky和Pudlak于1959年首次报道^[2], 以眼皮肤白化病和不同程度的出血倾向为主要临床特征, 部分亚型有肉芽肿性结肠炎、特发性肺纤维化等表现。依据致病基因的不同, HPS可分为10个亚型（HPS1-HPS10）。Anikster等^[3]于2001年首次将6个波多黎各HPS家系的致病基因HPS3基因定位于3号染色体q24。HPS基因产物参与溶酶体相关细胞器（Lysosome-related organelles, LRO）如黑素细胞中的黑素颗粒和血小板中的致密颗粒等物质的生成^{[4, 5]}。HPS病例在国内报道较少, Wei等^[6]曾报道10个中国HPS患者, 包含HPS1、HPS3、HPS5、HPS6 4型, 所发现的19个致病突变中, 有14个为新突变。本例患者仅有眼部及皮肤异常和出血倾向。通过外显子捕获和二代测序, 确定了致病突变为纯合小片段缺失：HPS3基因c.1868_1872delATGAA为新发突变, 该突变会改变HPS3基因的开放阅读框, 造成蛋白多肽链合成异常。

MCD是一种罕见的常染色体隐性遗传病, 通常在儿童期发病, 进展缓慢, 成年时视力受损严重, 以角膜基质层不规则斑块状混浊为主要临床特征。根据血清和角膜组织中硫酸角质素的含量差异将斑块状角膜营养不良分为三型：若血清和角膜组织中均缺乏硫酸角质素则称为MCD Ⅰ 型; 若血清中缺乏硫酸角质素而角膜细胞中含有硫酸角质素则称为MCD IA型; 若血清和角膜组织中硫酸角质素含量均正常则称为MCD Ⅱ 型, 其中以MCD Ⅰ 型最为多见^{[7, 8]}。Akama等^[9]于2000年首次将MCD的致病基因CHST6基因定位于16号染色体q22。CHST6基因编码的产物为N-乙酰葡萄糖胺-6-磺基转移酶, 该酶参与角膜硫酸角质素蛋白多糖的生物合成。CHST6基因突变导致异常的硫酸角质素, 其溶解性降低, 易在角膜基质层沉积, 产生角膜混浊^{[9, 10]}。本例患者角膜基质内可见明显的混浊斑块, 二代测序检测到CHST6基因c.530G> C（p.R177P）纯合错义突变, 该突变为新发突变, 突变预测工具Polyphen2、SIFT及Mutation Testing均预测该突变为疑似致病突变。该氨基酸位点为突变热点, 已报道的错义突变包括p.R177C（c.529C> T）^[11], p.R177G（c.529C> G）^[12]和p.R177H（c.530G> A）^[13], 推测该氨基酸位点的突变可能对蛋白质功能有较大的影响。

HPS综合征表型多样, 轻重不一。本例患者为轻型, 表现为眼皮肤白化病及轻度的出血倾向, 容易和白化病混淆, 也容易被漏诊。本例患者年幼时在多家医院就诊, 均诊断为弱视, 说明我们对于HPS尚缺乏清楚的认识。HPS眼部表现主要为虹膜色淡, 眼底色素缺失, 黄斑发育不良, 视力较差但相对稳定。该患者21岁开始视力出现进行性下降, 主要是由于角膜营养不良进展所致。另外, 该患者同时患有2种罕见的常染色体隐性遗传病, 这种情况非常少见, 原因为父母近亲结婚, 分别携带HPS3和CHST6基因杂合突变。这对夫妻的后代单独患HPS或MCD的概率为1/4, 同时患这2种疾病的概率为1/16。

本研究报道了1例同时患HPS3型和MCD的罕见病例及相关致病基因HPS3和CHST6的新突变。二代测序具有高覆盖率的特点, 是罕见复杂性遗传疾病分子诊断的最佳选择。

致谢 感谢患者及其家属的配合

利益冲突申明 本研究无任何利益冲突

作者贡献声明 孙子系：实施研究, 采集数据, 资料的分析和解释; 撰写论文; 对编辑部的意见进行修改。杨丽珠：参与资料的收集、分析和解释, 修改文章。李华晋：参与资料的收集、分析和解释, 修改文章。睢瑞芳：选题、设计实验, 修改论文中关键性的结果和结论, 对编辑部的意见进行核修