引用本文
李渊, 盛晓, 周锡松, 安建宏, 瞿佳. 利用Cre/loxP系统定位腺苷A2A受体在小鼠视网膜上的分布[J]. 中华眼视光学与视觉科学杂志, 2017,19(6): 350-355.
Yuan Li, Xiao Sheng, Xisong Zhou, Jianhong An, Jia Qu. Localizing the Distribution of the Adenosine A2A Receptor in the Mouse Retina Using a Cre/loxP System[J]. CHINESE jOURNAL OF OPTOMETRY OPHTHALMOLOGY AND VISUAL SCIENCE, 2017,19(6): 350-355.  
Doi:10.3760/cma.j.issn.1674-845X.2017.06.007
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利用Cre/loxP系统定位腺苷A2A受体在小鼠视网膜上的分布
李渊, 盛晓, 周锡松, 安建宏, 瞿佳
325027 温州医科大学附属眼视光医院
通信作者：瞿佳,Email：jqu@wz.zj.cn
收稿日期: 2017-04-01
基金资助: 国家自然科学基金（81470659）; 温州市科技计划项目（Y20140357,Y20150269）
摘要

目的 运用Cre/loxP系统来定位腺苷A2A 受体（A2AR）在小鼠视网膜上的分布情况。方法 实验研究。将雄性B6.FVB（Cg）-Tg（Adora2a-cre）KG139Gsat/Mmucd（简称A2A-cre）小鼠与雌性B6．129S6-Gt（ROSA）26Sortm9（CAG-tdTomato）Hze/J（简称Ai9）小鼠交配,对新生小鼠基因型进行鉴定,并选取5只4周龄A2A-cre+,Ai9鼠,此小鼠表达的Cre酶能敲除Ai9小鼠中的STOP序列使Tomato荧光蛋白表达。采用免疫荧光方法分别将Tomato红色荧光蛋白与不同类型的视网膜细胞抗体共标记,通过观察Tomato红色荧光蛋白和视网膜细胞特异性抗体的共定位结果,来明确A2AR在视网膜上的定位情况。结果 免疫荧光结果显示Tomato+细胞主要分布在视网膜神经节细胞层和内核层,外核层并没有发现。其中神经节细胞层中的Tomato+细胞少数为神经节细胞,多数为异位无长突细胞,而分布于内核层的Tomato+细胞主要为Müller细胞和无长突细胞。进一步对无长突细胞亚型分析发现,Tomato+无长突细胞多数为AⅡ型无长突细胞,而胆碱能无长突细胞和多巴胺能无长突细胞并无Tomato+表达。结论 在4周龄A2A-cre+,Ai9小鼠视网膜中,A2AR主要表达于神经节细胞、无长突细胞和Müller细胞中。

关键词: 腺苷A2A 受体; 视网膜; Cre/loxP系统; 小鼠
Localizing the Distribution of the Adenosine A2A Receptor in the Mouse Retina Using a Cre/loxP System
Yuan Li, Xiao Sheng, Xisong Zhou, Jianhong An, Jia Qu
Eye Hospital, Wenzhou Medical University, Wenzhou 325027, China
Corresponding author: Jia Qu, Eye Hospital, Wenzhou Medical University, Wenzhou 325027, China (Email: jqu@wz.zj.cn)
Fund:This study was funded by National Natural Science Foundation of China (81470659) and Wenzhou Science and Technology Plan Project (Y20140357, Y20150269)
Abstract

Objective: To localize the distribution of the adenosine A2A receptor (A2AR) in the mouse retina using a Cre/loxP system.Methods: In this experimental study, male A2A-cre mice [B6.FVB (Cg)-Tg (Adora2a-cre)KG139Gsat/Mmucd] were mated with female Ai9 mice [B6.129S6-Gt (ROSA) 26Sortm9 (CAG-tdTomato)Hze/J]. The genotypes of the newborn mice were identified and five A2A-cre+, Ai9 mice were chosen at 4 weeks of age. The Cre enzyme of the mice can knock out the STOP sequence of Ai9 mice, which will cause the expression of the tomato fluorescent protein. The localization of A2AR in the retina can be determined through the double immunostaining of the tomato red fluorescent protein and markers of different retinal cells.Results: Immunofluorescence microscopy showed that Tomato+ cells were mainly distributed in the ganglion cell layer and inner nuclear layer, and not in the outer nuclear layer. In the ganglion cell layer, the minority of Tomato+ cells were ganglion cells while the majority were ectopic amacrine cells. In the inner nuclear layer, Tomato+ cells were mainly Müller and amacrine cells. With further analysis of the amacrine cell subtypes, we discovered that most of the Tomato+ cells were AⅡ amacrine cells, not cholinergic or dopaminergic amacrine cells.Conclusions: This study suggests that A2AR is expressed in ganglion cells, amacrine cells, and Müller cells in 4-week-old mouse retinas.

Keyword: adenosine A2A receptor; retina; Cre/loxP system; mice

腺苷A2A受体（Adenosine A2A receptor, A2AR）是4种腺苷受体（A1、A2A、A2B和A3）其中之一[1, 2], 其与Gs蛋白偶联, 在葡萄膜黑色素瘤、青光眼、早产儿视网膜病变和近视等视网膜相关疾病中具有重要的调控作用[3, 4, 5, 6, 7, 8]。因此, 明确A2AR在何种视网膜细胞上表达是研究A2AR调控相关疾病分子机制的重要条件。以往对A2AR在视网膜上的定位主要基于早期放射自显影, 原位杂交和免疫组织化学技术[9, 10, 11, 12]。由于上述方法存在非特异性等局限性问题导致定位结果不是很一致。为此需要一种更特异性的方法来确定A2AR在视网膜上的定位。Cre/loxP重组酶系统中Cre重组酶能够特异性地敲除loxP位点之间的DNA[13]。利用此特性, 将A2A基因启动子驱动的Cre重组酶的小鼠与另一种荧光报告基因小鼠（在强启动子和Tomato基因之间有一个两端带有loxP位点的STOP序列, 正常情况下STOP序列阻止Tomato荧光标记蛋白的表达）。当2种转基因小鼠交配后, 就能够得到一种既带有cre基因又带有Tomato荧光报告基因小鼠, 只有表达A2A基因的细胞才能驱动Cre重组酶的表达, 此Cre酶进而能够敲除STOP序列使Tomato荧光蛋白表达, 从而可以间接定位A2A基因在细胞上的表达情况。本研究将利用上述Cre/loxP系统的特性并结合免疫荧光的方法来定位A2AR在小鼠视网膜细胞上的分布情况, 以期为A2AR在视网膜相关疾病中的分子机制研究提供依据。

1 材料与方法
1.1 材料

1.1.1 实验动物 实验研究。B6.FVB（Cg）-Tg（Adora2a-cre）KG139Gsat/Mmucd （简称A2A-cre）小鼠来自美国加利福尼亚大学戴维斯分校突变小鼠资源联盟（The Mutant Mouse Regional Resource Center）。B6.129S6-Gt（ROSA）26Sortm9（CAG-tdTomato）Hze/J（简称Ai9）小鼠来自美国杰克逊实验室（The Jackson Laboratory）。以上小鼠均在SPF级动物房饲养。动物的饲养与处理经温州医科大学动物伦理委员会审批通过, 并遵循眼科及视觉科学研究协会（The Association for Research in Vision and Ophthalmology）关于眼科和视觉研究中对动物的处理原则。

1.1.2 主要试剂及仪器 Chat（胆碱能无长突细胞marker）、TH（多巴胺能无长突细胞marker）和Calretinin（AⅡ 型无长突细胞marker）来自美国Millipore公司; Pax6（总的无长突细胞marker）来自美国Covance公司; Gs（Mü ller细胞胞体和轴突marker）来自美国BD公司; Brn-3a（神经节细胞marker）来自美国Santa Cruz公司; Sox9（Mü ller细胞核marker）来自美国Chemicon公司。蛋白酶K来自德国Merck公司; PCR相关试剂来自中国Takara公司。

PCR仪来自美国ABI公司; 激光共聚焦显微镜来自德国Zeiss公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠交配以及基因型鉴定 2只雄性A2A-cre+小鼠与4只雌性Ai9小鼠交配, 得到实验所需的A2A-cre+, Ai9 小鼠并经鉴定确认。剪取出生后7~10 d的小鼠脚趾, 放入EP管, 加250 μ l裂解液和2.5 μ l蛋白酶K（10 mg/ml）, 55 ℃摇床过夜直至组织完全裂解; 颠倒混匀过夜的裂解液和已裂解的组织, 向其加入100 μ l 氯化钠溶液（5 mol/L）, 颠倒混匀, -20 ℃静置10 min, 室温下离心10 min（13β 000 r/min）; 随后取上清液200 μ l, 转移至新的EP管中, 加400 μ l无水乙醇, 颠倒混匀, 离心10 min（13β 000 r/min）; 弃上清液, 加70%乙醇500 μ l, 离心5 min（7β 600 r/min）; 弃上清液, 室温干燥5~10 min; 加30 μ l灭菌水溶解DNA。所得DNA用于进一步PCR扩增鉴定基因型。

1.2.2 PCR扩增方法 A2A-cre基因型鉴定：加2.0 μ l MgCl2, 0.5 μ l dNTP, 2.5 μ l 10× buffer, 引物各1.0 μ l, 0.25 μ l Taq酶, 2.0 μ l样品, 最后加灭菌水至25 μ l。反应条件：94 ℃, 5 min; 然后94 ℃, 15 s; 65 ℃, 30 s; 72 ℃, 40 s共10个循环, 每个循环降1.0 ℃; 然后94 ℃, 15 s; 55 ℃, 30 s; 72 ℃, 40 s共30个循环; 72 ℃, 5 min。

Ai9基因型鉴定：加2.0 μ l MgCl2, 2.0 μ l dNTP, 2.5 μ l 10× buffer, 引物各1.0 μ l, 0.125 μ l Taq酶, 3.0 μ l样品, 最后加灭菌水至25 μ l。反应条件：95 ℃, 5 min; 然后95 ℃, 30 s; 65 ℃, 30 s; 72 ℃, 30 s共20个循环, 每个循环降0.5 ℃; 然后95 ℃, 30 s; 55 ℃, 30 s; 72 ℃, 30 s共20个循环; 72 ℃, 3 min。

1.2.3 免疫荧光检测方法 取5只4周龄A2A-cre+, Ai9小鼠, 予脱臼处死, 取出眼球, 4%多聚甲醛固定。30%蔗糖脱水后OCT包埋, 10 µ m厚度冰冻切片。5%山羊血清室温封闭2 h, 随后加入一抗并4 ℃孵育过夜, PBS（0.01 mol/L）清洗一抗, 随后加入二抗并室温孵育2 h, PBS清洗二抗, 用含有DAPI的抗荧光淬灭剂封片, 随后激光共聚焦拍照。

2 结果
2.1 基因型鉴定

用引物A2A-cre-F和A2A-cre-R进行扩增, cre 阳性条带为350 bp, 即cre+, cre 阴性条带没有条带扩增, 即cre-。用引物Ai9 WT-F和Ai9 WT-R, Ai9 Tomato-F和Ai9 Tomato-R分别扩增Flanked by loxp（fl）等位基因条带（482 bp）和野生型条带（200 bp）。鉴定引物见表1, 基因鉴定结果见图1。

图1. PCR 基因型鉴定Figure 1. Polymerase chain reaction genotype identification.
M, DNA marker DL2000; +, cre positive; -, cre negative; f+, heterozygous mice with tomato gene containing the STOP sequence; WT, wild-type mice without STOP sequence or tomato gene.

表1 基因型鉴定引物 Table 1 Primers of genotype identification
2.2 A2AR在视网膜神经节细胞上的表达

用标记神经节细胞的抗体Brn-3a进行免疫荧光染色发现, Tomato+细胞表达于神经节细胞层, 而对Tomato+细胞与视网膜神经节细胞抗体Brn-3a共标记发现, 仅部分Tomato+细胞与Brn-3a共标（见图2, 箭头所示）, 说明A2AR仅在部分神经节细胞上表达。

图2. 腺苷A2A 受体在小鼠视网膜神经节细胞上的定位
A：Tomato, 红色荧光蛋白, 代表A2A 受体表达; B：Brn-3a, 神经节细胞marker; C：Merge, DAPI、Tomato、Brn-3n 共标Figure 2. Localization of adenosine A2A receptors on the retinal ganglion cells in mice.
A: Tomato, red fluorescent protein, representing the expression of A2A receptors; B: Brn-3a, labeled ganglion cells; C: Merge, combining nuclei labelled by DAPI with Tomato and Brn-3a. ONL, outer nuclear layer; INL, inner nuclear layer; GCL, ganglion cell layer.

2.3 A2AR在视网膜无长突细胞上的表达

观察发现Tomato+细胞较多地表达于内核层（见图3A）。通过Tomato+细胞与无长突细胞抗体pax6的共标情况发现, 无论是在内核层还是神经节细胞层, Tomato+细胞与pax6均有较多的共标（见图3A、C、D）, 表明A2AR表达于异位无长突细胞和内核层无长突细胞。进一步对无长突细胞亚型进行分析发现, Tomato+无长突细胞多数为AⅡ 型无长突细胞（见图3B, 而胆碱能无长突细胞和多巴胺能无长突细胞并没有Tomato+表达（见图3E-H）。在Tomato+和pax6+共标的细胞中有部分和AⅡ 型无长突细胞抗体calretinin没有共标, 表明存在其他类型无长突细胞表达Tomato红色荧光蛋白。

图3. 腺苷A2A 受体在小鼠视网膜无长突细胞上的定位
A、E：Tomato, 红色荧光蛋白, 代表A2A 受体的表达; B：calretinin, AⅡ 无长突细胞marker; C：pax6, 所有无长突细胞marker; D：Merge, Tomato、Calretinin、pax6 共标; F：Th, 多巴胺能无长突细胞marker; G：Chat, 胆碱能无长突细胞marker; H：Merge, Tomato、Th、Chat 共标Figure 3. Localization of adenosine A2A receptors on retinal amacrine cells in mice.
A, E: Tomato, red fluorescent protein, representing the expression of A2A receptors; B: calretinin, AII amacrine cell marker; C: pax6, marker of all amacrine cells; D: Merge, combining labeling by Tomato, calretinin, and pax6; F: Th, dopaminergic amacrine cell marker; G: Chat, cholinergic amacrine cell marker; H: Merge, combining labeling by Tomato, Th, and Chat. ONL, outer nuclear layer; INL, inner nuclear layer; GCL, ganglion cell layer.

2.4 A2AR在视网膜Mü ller细胞上的表达

表达于内核层的Tomato+细胞与Mü ller细胞特异性抗体Gs共标发现, Tomato+细胞与pax6完全共标（见图4A、B、D）。为了便于观察, 进一步将仅标记Mü ller细胞核的抗体sox9与Tomato共标, 结果显示sox9与Tomato完全共标（见图4A、C、D）。上述结果说明A2AR表达于Mü ller细胞上。

图4. 腺苷A2A 受体在小鼠视网膜Mü ller 细胞上的定位
A：Tomato, 红色荧光蛋白, 代表A2A 受体表达; B：Gs, Mü ller 细胞marker, 标记胞体和突触; C：sox9, Mü ller 细胞marker, 标记细胞核; D：Merge, Tomato、GS、Sox9 共标Figure 4. Localization of the adenosine A2A receptor on retinal Mü ller cells in mice.
A: Tomato; B: Gs, Mü ller cell marker labeling tomato and synapse; C: sox9, Mü ller cell marker, label nucleus; D: Merge, combining labeling by Tomato, Gs, and sox9. ONL, outer nuclear layer; INL, inner nuclear layer; GCL, ganglion cell layer.

3 讨论

A2AR是4种腺苷受体（A1、A2A、A2B和A3）其中之一, 其与Gs蛋白偶联, 发挥多种生物学作用[1, 2]。越来越多的研究发现A2AR在视网膜相关疾病中具有重要的调控作用, 如A2AR能减轻大鼠视网膜缺血再灌注损伤[5, 6]; 失活的A2AR能够减轻早产儿视网膜病变模型的病变程度[7]; A2AR能够通过缝隙连接蛋白磷酸化调控小鼠光感细胞的信号转导[14]; 抑制A2AR可以使大鼠视网膜神经节细胞免受小胶质细胞介导的炎性损伤[4]; A2AR可通过大鼠星型无长突细胞上调视网膜波频率等[12]。本课题组前期研究发现通过同源重组方法构建的全身敲除A2AR能够导致小鼠相对近视, 并且出现了眼轴延长、玻璃体腔延长等近视的特征性改变[8]。因此, 明确A2AR在视网膜相关疾病中的调控机制具有重要意义。

明确A2AR所表达的细胞类型是研究A2AR调控疾病分子机制的重要条件。目前对A2AR在视网膜上的定位研究主要基于之前几个研究结果：利用放射自显影技术显示A2类受体主要表达于感光细胞层, 但并不能区分受体类型是A2A还是A2B, 且存在背景干扰、不安全、不方便等问题[9, 10]; 利用原位杂交技术显示A2AR强表达于大鼠视网膜的内核层, 其次表达于神经节细胞和外核层细胞, 此方法也有一定背景干扰, 仅能显示mRNA水平的表达情况, 并且没有区分A2AR所表达的细胞类型[11]; 免疫荧光技术显示A2AR表达于星型无长突细胞上, 而其他类型细胞并没有检测到[12], 此方法受制于抗体的质量。以上不同的检测方法由于其不同的局限性而导致检测结果也有所不同。

近来利用转基因技术来定位基因所表达的细胞类型已显示出一定的优势。例如通过特定基因启动子构建一个荧光蛋白来显示此基因可能表达的细胞类型[15]。通过Cre/loxP或Ftp/FRT重组酶系统特异性地表达荧光蛋白, 特别是Cre/loxP系统在此方面应用较多。此系统主要利用Cre重组酶能够特异性地敲除loxP位点之间的DNA。比如构建带有荧光标记的小鼠, 此小鼠荧光蛋白序列前有一个两端带有loxP位点的STOP序列, 可阻止荧光蛋白表达。另外再构建一个目的基因启动子驱动的Cre转基因小鼠。将此2种小鼠交配, Cre重组酶就能将loxP位点间的STOP序列敲除, 从而产生具有荧光表达的小鼠, 进而能够确定此基因所表达的位置。

本研究利用Cre/loxP系统来探讨A2AR在小鼠视网膜上的定位。此系统需要2种转基因小鼠：一种是A2A启动子驱动的cre基因即A2A-cre小鼠[16]; 另一种是在rosa26位点插入Tomato红色荧光蛋白基因, 并在此序列前加入一个两端带有loxP位点的STOP序列即Ai9小鼠[13]。正常情况下Ai9小鼠不表达Tomato红色荧光蛋白, 只有将其与A2A-cre小鼠交配, 在Cre重组酶作用下特异性地将STOP序列敲除进而使Tomato红色荧光蛋白表达。然后将Tomato与视网膜细胞特异性的抗体共标记。利用此种特性就能够特异性地检测A2AR在视网膜上的定位分布情况。

Tomato+细胞在视网膜上定位结果显示, 在4周龄小鼠视网膜中A2AR主要表达于视网膜神经节细胞层和内核层, 其结果和前期原位杂交结果一致[9, 10]; 而在外核层没有表达, 其结果与早期放射自显影和原位杂交结果并不一致[11]。出现外核层检测结果不一致现象可能由于Tomato红色荧光蛋白在感光细胞表达较低以至于很难检测到。Tomato+细胞与视网膜细胞特异性抗体共标结果显示, A2AR主要表达的细胞类型为神经节细胞、AⅡ 型无长突细胞以及Mü ller细胞, 胆碱能和多巴胺能无长突细胞无表达, 而早期免疫荧光结果中显示A2AR主要表达于星型无长突细胞即Chat+细胞[12]。出现此种不一致现象可能与抗体的特异性有关, 目前没有更特异性的抗体用于检测视网膜上A2AR的表达情况。

综上所述, Cre/loxP系统定位A2AR在视网膜细胞上的分布, 具有易操作和特异性等优点。但此方法也存在一些不足之处, 比如表达水平较低时很难检测到相关基因的表达情况且构建此转基因小鼠需要较高的技术和费用。本研究结果显示在4周龄小鼠视网膜中, A2AR表达于神经节细胞、无长突细胞和Mü ller细胞。此方法不仅明确了A2AR在视网膜上所表达的细胞类型而且在A2AR调控视网膜相关疾病的分子机制研究中具有重要的意义。

利益冲突申明 本研究无任何利益冲突

作者贡献说明 李渊：收集数据, 参与选题、设计及资料的分析和解释; 撰写论文; 对编辑部的修改意见进行修改。盛晓、周锡松：参与选题、设计和修改论文的结果、结论。安建宏、瞿佳：参与选题、设计、资料的分析和解释, 修改论文中关键性结果结论, 对编辑部的修改意见进行核修。

The authors have declared that no competing interests exist.

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