引用本文
高青, 沈雨濛, 娄翔峰, 罗雪, 卢苇, 沈吟. 全细胞膜片钳结合单细胞RT-PCR技术在NMDA诱导的小鼠青光眼模型视网膜双极细胞G蛋白通路研究中的应用[J]. 中华眼视光学与视觉科学杂志, 2017,19(8): 462-467.
Qing Gao, Yumeng Shen, Xiangfeng Lou, Xue Luo, Wei Lu, Yin Shen. Application of the Whole-cell Patch Clamp Combined with Single-cell RT-PCR in an NMDA-induced Glaucoma Mouse Model of the G-protein Pathway in Retinal ON-type Bipolar Cells[J]. CHINESE JOURNAL OF OPTOMETRY OPHTHALMOLOGY AND VISUAL SCIENCE, 2017,19(8): 462-467.
Doi:10.3760/cma.j.issn.1674-845X.2017.08.003  
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全细胞膜片钳结合单细胞RT-PCR技术在NMDA诱导的小鼠青光眼模型视网膜双极细胞G蛋白通路研究中的应用
高青, 沈雨濛, 娄翔峰, 罗雪, 卢苇, 沈吟
430060 武汉大学人民医院眼科中心
通讯作者：沈吟,Email：yinshen@whu.edu.cn
收稿日期: 2017-03-29
基金资助: 国家自然科学基金面上项目（81470628、81270998）; 湖北省自然科学基金杰出青年项目（2014CFA019）; 湖北省卫计委青年人才项目（WJ2015Q014）
摘要

目的 介绍一种视网膜全细胞膜片钳联合单细胞逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术在视网膜单细胞信号成分分析中的应用,并研究N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）对ON型双极细胞中G蛋白相关mRNA表达的影响。方法 实验研究。3~5周龄C57BL/6J小鼠20只随机分为2组,每组各10只,分别玻璃体腔注射3 μl NMDA（30 nmol/L）构建青光眼模型,3 μl PBS（10 nmol/L）作为对照组,24 h后取视网膜,膜片钳下钳取单个ON型双极细胞,并做RT-PCR观察几种目的mRNA的表达差异。2组间各参数比较采用Mann-Whitney检验。结果 RT-PCR结果显示蛋白激酶Cα亚基（PKCα）、瞬时感受电位离子通道1（TRPM1）、G蛋白α亚单位（Gαo）的表达在NMDA青光眼模型构建后分别为0.536 ± 0.339、0.337 ± 0.271、4.36 ± 1.83,构建前后差异有统计学意义（ U=0, P=0.001; U=0, P=0.002; U= 36, P=0.002）。结论 NMDA诱导的青光眼模型可影响视网膜ON型双极细胞G蛋白耦联通道的信号传导。

关键词: 膜片钳; 单细胞逆转录聚合酶链式反应; 视网膜双极细胞; N-甲基-D-天冬氨酸; G蛋白; 小鼠
Application of the Whole-cell Patch Clamp Combined with Single-cell RT-PCR in an NMDA-induced Glaucoma Mouse Model of the G-protein Pathway in Retinal ON-type Bipolar Cells
Qing Gao, Yumeng Shen, Xiangfeng Lou, Xue Luo, Wei Lu, Yin Shen
Eye Center, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, China
Corresponding author: Yin Shen, Eye Center, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, China (Email: yinshen@whu.edu.cn)
Fund:This study was funded by National Natural Science Fund of China (81470628, 81270998), Hubei Province Natural Science Fund Preeminent Youth Project (2014CFA019), and Hubei Provincial Health Commission Excellent Scientist Project (WJ2015Q014).
Abstract

Objective: To introduce the application of a retinal whole-cell patch clamp combined with a single-cell reverse transcription polymerase chain reaction in retinal single-cell component analysis and to investigate the effects of N-methyl-D-aspartate (NMDA) on G-protein related mRNA expression by ON-type bipolar cells of the retina.Methods: In this experimental study, twenty 3-5 weeks old C57BL/6J mice were randomly and equally divided into two groups. They then received a 3 µl intravitreal injection of 30 nmol/L NMDA for the induced-glaucoma group or 10 nmol/L phosphate-buffered saline (PBS) for the control group. Twenty-four hours later, ON-type bipolar cells were collected by patch clamp electrode, and RT-PCR was used to determine the relative expression of mRNAs for protein kinase C alpha (PKCα), transient receptor potential melastatin 1 (TRPM1), and G-protein alpha subunit (Gαo). The two groups were compared by Mann-Whitney tests.Results: After intravitreal injection of NMDA, the relative mRNA expression in ON-type bipolar cells of PKCα (0.536±0.339), TRPM1 (0.337±0.271), and Gαo (4.36±1.83) were significantly different from the control eyes ( U=0, P=0.001; U=0, P=0.002; U=36, P=0.002).Conclusion: NMDA-induced glaucoma model may affect the signal transduction of G protein-coupled channel of retinal ON bipolar cells.

Keyword: patch clamp; single-cell RT-PCR; retina bipolar cell; N-methyl-D-aspartate; G-protein; mice

膜片钳技术和逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术自发明以来, 对于单细胞电生理和分子生物学有了极大的促进, 在微观学上有重大意义。经过多年发展, 1992年, Lambolez等[1]首次组合全细胞膜片钳记录和单细胞RT-PCR, 在各个电生理信号记录结束时用钳制电极收获mRNA到移液管中, 而后将其mRNA逆转录成cDNA, 进行PCR扩增, 进而测定单个小脑浦肯野细胞中谷氨酸受体AMPA亚型的mRNA的表达情况。

本实验通过结合全细胞膜片钳和单细胞RT-PCR, 测定视网膜ON型双极细胞中部分G蛋白相关mRNA表达, 介绍了一种应用于视网膜的结合分子生物学与电生理学的实验方法。异源三聚体G蛋白在静息状态下由Gα 、Gβ γ （G蛋白β 、γ 亚基二聚体复合物）亚基组成, 其关键功能是将代谢型受体与其下游效应因子耦联[2]。在视网膜中, 重要的G蛋白介导的信号传导级联发生在一种二级神经元, ON型双极细胞中。暗环境下, 从光受体释放的谷氨酸结合谷氨酸代谢型受体6（Glutamate receptor metabotropic 6, mGluR6）, 使异源三聚体G蛋白的α 亚单位与二磷酸鸟苷（Guanosine diphosphate, GDP）的亲和力下降, 与三磷酸鸟苷（Guanosine triphosphate, GTP）的亲和力增加, 故α 亚单位转而与GTP结合。α 亚单位与GTP的结合诱发了其本身的构象改变, 使α 亚单位与β 、γ 亚单位相分离, 且从受体上分离成为游离的α 亚单位。Gα 将代谢型受体mGluR6耦联到瞬时感受电位离子通道（Transient receptor potential melastatin 1, TRPM1）通道并在黑暗中关闭它, 从而使细胞超极化。在光刺激下, 光感受器超极化, 减少谷氨酸释放, 打开TRPM1通道, 从而去极化双极细胞。通过GTPase活化蛋白, 打开TRPM1和去极化细胞[3, 4, 5, 6, 7]。N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）可通过模拟神经兴奋毒性的谷氨酸升高, 导致神经节细胞上NMDA受体激活, 使细胞内钙超载诱导视网膜神经节细胞（Retinal ganglion cell, RGC）死亡[8]。但NMDA对于双极细胞的影响机制暂不清楚。本实验分别钳取NMDA造模的小鼠和注射PBS对照的正常的小鼠的单个ON型双极细胞, 对比分析了蛋白激酶α （Protein kenase Cα , PKCα ） （视杆双极细胞中特异性表达蛋白, 视杆双极细胞皆为ON型双极细胞）、TRPM1、G蛋白α （Gα o） （Gα 亚基分类下腺苷酸环化酶抑制性亚单位）3种mRNA的表达情况。与细胞群RT-PCR不同, 该方法在膜片钳下可准确、直观地钳取单个目的细胞, 可以更精准地研究单类细胞之间的差异。

1 材料与方法
1.1 实验动物

健康清洁级C57BL/6J雄性小鼠3~5周龄20只[由武汉大学实验动物中心提供, 批号：SCXK（鄂）2014-0004], NMDA组和对照组各10只, 动物的饲养和处理符合动物实验伦理, 遵照动物使用的有关规定。

1.2 主要仪器及试剂

10 μ l微量注射器（美国Hamilton公司）; 渗透压仪（美国WESCOR公司, 型号5600）; 微电极拉制仪（日本Narishige公司）; CCD像机（日本Hamamatsu公司）; 硼硅酸盐玻璃微电极（美国Sutter Instrument公司, 内径1.0 mm）; RT-PCR仪（美国ABI7500型实时定量PCR仪）; 5%水合氯醛; 30 nmol/L NMDA（溶解于10 mmol/L PBS溶液, 美国Sigma公司）; 细胞外液Ringer's（含140 mmol NaCl、5 mmol KCl、2 mmol CaCl2、20 mmol HEPES、1 mmol MgCl2、10 mmol Glucose, 用NaOH调pH至7.3~7.4, 渗透压295~305 mOsm/L）; 细胞内液（含145 mmol CsCl, 10 mmol HEPES, 0.5 mmol EGTA, 4 mmol ATP, 1 mmol GTP, 用氢氧化铯调pH至7.3）; RT-PCR反应体系QuantiTcet Reverse Transcription试剂盒（德国QIAGEN公司）; 引物序列见表1（上海生工生物工程）。

表1 ON型双极细胞及G蛋白耦联相关蛋白mRNA的RT-PCR引物序列 Table 1 The RT-PCR primers for ON bipolar cells and G protein pathways
1.3 小鼠NMDA造模方法

小鼠腹腔注射5%水合氯醛（0.07 ml/10 g）全身麻醉满意后, 用消毒灭菌后的连接30G针头的微量注射器吸取3 μ l配制好的30 nmol/L NMDA, 显微镜下于小鼠左眼角巩膜缘进针, 缓慢推入液体, 维持几秒, 右眼注射相同量的PBS作为对照。术后于结膜囊内涂红霉素眼膏。

1.4 视网膜薄片制备

NMDA注射后24 h将小鼠脱颈椎处死, 取眼球, 放入持续灌注氧气低温保存的Ringer's溶液中, 去除角膜、晶状体, 清理眼内玻璃体, 小心剥下视网膜, 用亲水纸转移至用凡士林贴好微孔滤膜（美国Millipore公司, 孔径0.22 μ m）的浴槽上, 神经节细胞层朝下, 滴加充氧的Ringer's液, 手动切片机切片, 每片间隔150 μ m, 在显微镜下用镊子小心转移视网膜切片, 置预先涂上凡士林的浴槽上固定, 使视网膜横截面朝上。

1.5 全细胞膜片钳吸取单细胞内容物

在膜片钳显微镜下找到双极细胞, 有研究表明ON型双极细胞的轴突可伸达视网膜内丛状层的内层, 即靠近神经节细胞层的部分[9], 用电阻值为7~8 MΩ 的玻璃微电极靠近该细胞, 用嘴吸, 给予玻璃微电极一个负压环境, 使旁边目的细胞紧密贴上电极。ON型双极细胞是一类给光后去极化的双极细胞, 在本实验中根据其位置及形态直接钳取。继续给负压, 将单细胞内容物吸入玻璃微电极中, 再通过三通管将单细胞内容物导入PCR管中。每个PCR管中可置入10~15个单个ON型双极细胞。

1.6 RT-PCR

在冰上放置含有单个细胞的PCR管、gDNA Wipeout Buffer、Quantiscript Reverse Transcriptase、Quantiscript RT Buffer、RT Primer Mix、RNase-freewater, 混匀, 离心, 放回冰上保存。在无RNA酶EP管中加入2 μ l gDNA Wipeout Buffer, 1 μ l RNA样本, 再补足无RNA酶水至14 μ l。将PCR管加热至42 ℃ 2 min, 以排除基因组DNA的污染, 然后立即放在冰上冷却。在冰上准备反转录体系, 包括有Quantiscript ReverseTranscriptase 1 μ l, Quantiscript RT Buffer 5× （包括Mg2+和dNTPs）4 μ l, RT Primer Mix 1 μ l, 最后加入之前的14 μ l RNA样本, 总体积为20 μ l, 保存在冰上。使用Reverse Transcription Kit进行反转录反应。对于cDNA扩增, 使用PKCα 、TRPM1、Gα o的特异性引物（见表1）以及作为内部对照的GAPDH引物以排除基因组DNA的污染。使用授权的热循环仪（Applied Biosystems, 美国Thermo Fisher Scirntific 公司）进行扩增, 并且通过2%琼脂糖凝胶电泳分析10 μ l的每个扩增的转录物。

1.7 统计学方法

实验研究。采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。实验数据以 x̅± s表示。本实验为小样本非正态分布, 方差不齐, 故选用非参数、两独立样本Mann-Whitney检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 全细胞膜片钳钳取ON型双极细胞

图1A为镜下拍得的玻璃微电极钳取双极细胞图片, 图1B为细胞注射荧光染料（Dextran, Alexa Fluro 488）后, 可见双极细胞轴突伸达内丛状层（Inner plexiform layer, IPL）底端（白色箭头所指）, 靠近神经节细胞层, 故可确认为ON型双极细胞。图1C为图1A和图1B的merge。

图1. 全细胞膜片钳钳取ON型双极细胞
A：镜下拍得的玻璃微电极钳取双极细胞图（黑色箭头所指为钳取的细胞, 两条白线所围为玻璃微电极）; B：注射Alexa Fluro 488后可见双极细胞荧光。PR为光感受器细胞层, ONL为外核层, OPL为外丛状层, INL为内核层, IPL为内丛状层, GCL为神经节细胞层。Figure 1. Whole-cell patch clamp of ON bipolar cells.
A: The black arrow indicates an ON bipolar cell soma, and the two white lines are the glass pipette; B: Alexa Fluro 488 injection of the bipolar cell. The white arrow indicates that the process of this bipolar cell reaches the IPL next to the GCL; C: A merged image of panels A and B. PR, photoreceptor layer; ONL, outer nuclear layer; OPL, outer plexiform layer; INL, inner nuclear layer; IPL, inner plexiform layer; GCL, ganglion cell layer.

2.2 RT-PCR结果

实验组为NMDA处理24 h后ON型双极细胞内mRNA表达情况, 对照组为PBS处理后24 h ON型双极细胞内mRNA表达情况。在RT-PCR反应中, Ct值是指每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数, RQ值是比较的Ct值, 它经过数学公式变形而来, 代表PCR过程中荧光信号变化量, 数值变小代表所检测的RNA水平降低。均以GAPDH为内参标准化, 将对照组的RQ值标准化为1, 进行Mann-Whitney统计分析。PKCα 为0.536 ± 0.339, 表达显著下调（n=9, U=0, P=0.001）, TRPM1为0.337 ± 0.271, 表达显著下调（n=8, U=0, P= 0.002）, Gα o为4.36 ± 1.83, 表达显著上调（n=6, U=36, P=0.002）, 三者差异均有统计学意义（见图2）。

图2. 小鼠NMDA造模与PBS组ON型细胞内G蛋白相关mRNA表达的差异比较
A: 以GAPDH为内参标准化后的统计结果; B: RT-PCR跑胶结果。C为注射PBS的对照组, N为注射NMDA的实验组。NMDA, N-甲基-D-天冬青酸。 aP< 0.05Figure 2. Differences between NMDA- and PBS-treated mice in G-protein signal pathway mRNA expression.
A: Statistical analysis after glyceraldehyde phosphate dehydrogenase (GAPDH) standardization. B: RT-PCR agarose gel electrophoresis results. NMDA, N-methyl-D-aspartate; PBS, phosphate-buffered saline; PKCα , protein kinase C alpha; TRPM1, transient receptor potential melastatin 1; Gα o, G-protein alpha subunit; C, PBS injection-controlled mice; N, NMDA-injected mice. aP< 0.05, Mann-Whitney test.

3 讨论

本实验提供了全细胞膜片钳组合单细胞RT-PCR提取ON型双极细胞内mRNA的方法, 并研究了ON型双极细胞内PKCα 、TRPM1、Gα o 3种mRNA的表达, 结果表明实验组与对照组相比差异有统计学意义。PKCα 为视网膜双极细胞中特异性表达的蛋白激酶, 有文献报道PKCα 是影响双极细胞信号转导和终止的重要调节剂[10], 它在NMDA造模的C57小鼠中表达下调, 说明NMDA造模后双极细胞信号转导功能受损。所以, NMDA不仅可以诱导神经节细胞凋亡, 也可以损伤双极细胞。TRPM1 mRNA表达水平降低, 说明TRPM1在NMDA造模后转录效率降低, 进一步说明了NMDA对双极细胞的损伤作用。Gα o mRNA表达水平升高, 说明给光或撤光后, 由于Gα o蛋白的增多, 谷氨酸减少或增多对ON型双极细胞膜上的mGluR6与Gα o的结合或解离的影响变小, 从而使ON型双极细胞信号传导反应减弱。PKCα 、TRPM1、Gα o的变化都表明了NMDA诱导的青光眼模型可损伤视网膜ON型双极细胞信号传导功能。此外, 本实验所检测的mRNA表达的显著性改变可能是由于NMDA诱导DNA的转录水平改变造成的, 其中mRNA的降低也可能是因为mRNA的不稳定性降解造成。下一步的工作需要检测这些mRNA的稳定性。几乎所有真核mRNA转录都需要一个两步过程：前体mRNA在3'端的核酸内切以及通过polyA聚合酶将polyA尾部聚合到mRNA分子上。这是mRNA稳定性, 转录物的核输出和高效翻译的基础。polyA尾部的长度对于成熟mRNA到细胞质的转运, 某些发育阶段的翻译效率以及mRNA的质量控制和降解是至关重要的[11]。故可以用深度测序的方法检测ployA尾部的长度变化。而NMDA具体是如何影响ON型双极细胞转录水平, 为何PKCα 、TRPM1表达降低而Gα o表达增高, 还有待进一步的研究。

全细胞膜片钳联合RT-PCR技术已经广泛应用在各个生物技术之中。结合电生理技术, 可以研究细胞膜特定离子通道或特定受体细胞内的mRNA表达, Audinat等[12]于1994年通过联合膜片钳记录和逆转录聚合酶链反应, 在大鼠小脑单个颗粒细胞中获得NMDA受体的功能性质和NR2A-2C mRNA的表达之间的相关性。它可以去除群体的综合平均性, 使研究内容更特异化、精准化, 体现细胞的异质性。Kanumilli等[13]在2006年通过检测单个小浦肯野细胞中mRNA的表达发现CaV2.1转录本比小脑中总转录本种类少, 并联合其他电生理结果, 提出在不同的脑神经元和物种中不同类型的CaV2.1转录物有选择性地表达。还可以联合药理学, 用膜片钳对单个特定目的细胞给药, 检测药物对该细胞的影响, 如研究某种药物对神经系统的保护机制。全细胞膜片钳联合SC-RT-PCR也有易受干扰, 波动较大的缺陷, 需要大样本重复检测以减小误差。

在视网膜研究方面, Fries等[14]于2005年通过生理学, 单细胞RT-PCR和免疫组织化学鉴定人类神经胶质细胞中的P2Y受体亚型。用膜片钳技术测量由新鲜分离的人Mü ller细胞中P2Y受体活化介导的Ca2+依赖性K+电流的增加。使用几种P2激动剂后, 将细胞收集到移液管中并进行单细胞RT-PCR, 发现人Mü ller细胞表达P2Y1、P2Y2、P2Y4和P2Y6受体。

相较于极限稀释法、流式单细胞分选、液滴阵列等单细胞RT-PCR技术, 膜片钳技术操作更简单, 无需离体培养, 更贴近细胞在体生理性质。但全细胞膜片钳联合单细胞RT-PCR应用, 能够研究的单细胞数量非常有限。Shekhar等[15]2016通过流式细胞术分选了25 000个视网膜双极细胞, 用Drop seq的方法确定了15种类型小鼠视网膜双极细胞, 并确定了几十个生物标记物, 使细胞在分子水平与其显微形态一一匹配。这项工作提供了一个系统的方法, 实现神经元的综合分子分类, 识别新型神经元类型, 并揭示亚分类下的转录差异。

联合电生理学和分子生物学, 多学科互相融合渗透, 是当今时代的迫切需求。全细胞膜片钳联合单细胞RT-PCR技术的应用前景广泛, 如联合基因测序, 测定特定的一个或一类细胞中DNA的变异情况, 与RT-PCR 单细胞mRNA水平比较, 可更精准地进行疾病的细胞分子水平的定位。在精准医疗及表观遗传学研究的应用方面有较好的前景。

作者贡献声明 高青：收集数据, 参与选题、设计及资料的分析和解释; 撰写论文; 对编辑部的修改意见进行修改; 沈雨濛：参与选题、设计和修改论文的结果、结论, 指导实验技术; 娄翔峰、罗雪、卢苇：参与选题、设计、资料的分析和解释, 指导实验方法技术; 沈吟：参与选题、设计, 修改论文中关键性结果、结论, 对编辑部的修改意见进行核修

The authors have declared that no competing interests exist.

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