引用本文
张亚丽, 刘丽梅, 刘玉强, 张少斌, 明春秀, 刘丽峰. 离子导入角膜胶原交联法治疗兔棘阿米巴性角膜炎[J]. 中华眼视光学与视觉科学杂志, 2017,19(9): 533-539.
Yali Zhang, Limei Liu, Yuqiang Liu, Shaobin Zhang, Chunxiu Ming, Lifeng Liu. Experimental Treatment of Acanthamoeba Keratitis in Rabbit Eyes by Drug and Iontophoretic Collagen Crosslinking[J]. CHINESE JOURNAL OF OPTOMETRY OPHTHALMOLOGY AND VISUAL SCIENCE, 2017,19(9): 533-539.  
Doi:10.3760/cma.j.issn.1674-845X.2017.09.004
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离子导入角膜胶原交联法治疗兔棘阿米巴性角膜炎
张亚丽, 刘丽梅, 刘玉强, 张少斌, 明春秀, 刘丽峰
261061 潍坊医学院（张亚丽）;261041 潍坊眼科医院 潍坊市眼科研究所（刘丽梅、刘玉强、张少斌、明春秀、刘丽峰）
通讯作者:张少斌,Email：zhangsb518@163.com
收稿日期: 2017-05-27
摘要

目的：评价离子导入角膜胶原交联法治疗兔眼棘阿米巴性角膜炎的效果。方法：实验研究。采用随机数字表法将40只（80眼）实验兔平均分为模型组（A组）、药物组（B组）、交联组（C组）、药物联合交联组（D组）,每组各10只。均选取右眼为实验眼,左眼为对照眼。A组不治疗,B组给予药物治疗,C组给予交联治疗,D组给予药物联合交联治疗。治疗90 d后行裂隙灯显微镜、共聚焦显微镜和角膜组织病理切片检查。共聚焦显微镜选取病变区深度分别为100、200、300 μm的图片,对图像中棘阿米巴包囊的密度使用Image J图像处理软件进行测定。所得实验数据采用Kruskal-Wallis H检验和2×2的析因设计方差分析进行分析。结果：治疗90 d后,裂隙灯显微镜示各组角膜病变不同分级的眼数不同,差异具有统计学意义（ χ2=19.738, P < 0.001）,药物组与模型组、交联组与模型组差异均有统计学意义（ P < 0.05）,药物组与交联组差异无统计学意义（ P=0.189）。共聚焦显微镜显示药物组、交联组、联合组棘阿米巴原虫密度值均低于模型组,差异具有统计学意义（均 P < 0.05）,药物组与交联组在治疗上存在交互作用,这种交互作用表现为协同作用。组织病理切片HE染色显示药物组、交联组、联合组棘阿米巴原虫密度值均低于模型组,差异具有统计学意义（均 P < 0.05）,药物组与交联组在治疗上存在交互作用,这种交互作用表现为协同作用。结论：离子导入角膜胶原交联法治疗兔眼棘阿米巴性角膜炎有效,且药物联合交联的效果明显优于单纯药物疗法和单纯交联疗法。

关键词: 胶原交联; 离子导入; 角膜炎,棘阿米巴; 包囊
Experimental Treatment of Acanthamoeba Keratitis in Rabbit Eyes by Drug and Iontophoretic Collagen Crosslinking
Yali Zhang1, Limei Liu2, Yuqiang Liu2, Shaobin Zhang2, Chunxiu Ming2, Lifeng Liu2
1Weifang Medical University, Weifang 261061, China
2Weifang Eye Institute, Weifang Eye Hospital, Weifang 261041, China
Corresponding author: Shaobin Zhang, Weifang Eye Institute, Weifang Eye Hospital, Weifang 261041, China (Email: zhangsb518@163.com)
Abstract

Objective: To evaluate the efficacy of drug treatment and iontophoretic collagen crosslinking alone and in combination in the treatment for acanthamoeba keratitis in rabbits.Methods: Rabbit corneas were scraped with circular blades and 0.1 ml acanthamoeba suspension was injected into the central corneal stroma. The injection caused a~3.0-mm diameter white edematous area. A soft corneal contact lens was then applied. Forty-eight hours after acanthamoeba were injected into the corneal stroma, the rabbits were randomly divided into four groups: Group A, untreated ( n=10). Group B, treated 7 times/day with eyedrops containing 0.02% chlorhexidine combined with 2% metronidazole ( n=10). Group C, stromal crosslinking with 0.1% riboflavin penetration by 5 min of iontophoresis, followed with 370 nm ultraviolet irradiation (10 mW/cm2, 9-mm aperture diameter, 9 min, total energy 5.4 J) ( n=10). Group D, drug+crosslinked treatment ( n=10). The right eye was selected as the experimental eye, and the left eye was the control eye. After treatment for 90 days, slit-lamp microscopy, confocal microscopy, and corneal histopathology were performed. Confocal microscopy was used to select the images with lesion depths of 100, 200, and 300 μm. The density of the acanthamoeba in each image was measured by Image J software. The experimental data were analyzed by Kruskal-Wallis H tests and 2×2 analysis of variance analysis.Results: After treatment for 90 days, the number of corneal lesions was significantly different in four groups ( χ2=19.738, P<0.001). The classification of corneal lesions in the Groups B and C was significantly lower than that in the Group A, and the difference was statistically significant ( P<0.05). The large reduction in the number of corneal lesions in Group D showed that the drug treatment and crosslinking acted synergistically to control the infection. Confocal microscopy measurements of the acanthamoeba density were significantly lower in the Groups B, C and D compared with the Group A ( P<0.05). The combination of drug and crosslinking treatment synergistically lowered the density of the parasites. Histopathological sections stained by hematoxylin and eosin confirmed the reduced density of acanthamoeba in the three treated groups compared to the Group A ( P<0.05). The combination of drug and crosslinking treatment synergistically lowered the density of the parasites.Conclusions: Iontophoretic corneal collagen crosslinking of acanthamoeba keratitis in rabbit eyes is effective. The combination of drug therapy and crosslinking is superior to local drug therapy alone or simple crosslinking alone.

Keyword: collagen cross-linking; iontophoresis; acanthamoeba keratitis; cyst

棘阿米巴性角膜炎（Acanthamoeba keratitis, AK）是由棘阿米巴原虫感染引起的慢性、进行性、疼痛性角膜溃疡[1]。棘阿米巴性角膜炎的发生与一定的危险因素有关, 主要包括角膜外伤、配戴角膜接触镜[2]、接触污染的水源等。棘阿米巴性角膜炎主要以药物治疗为主, 但效果欠佳[1, 2]。因此, 许多学者开始探索新的治疗方法。研究表明, 核黄素紫外线角膜胶原交联法不但可以使角膜的机械强度增加, 亦可提高角膜的抗酶解能力, 因此广泛应用于细菌及真菌性角膜溃疡的治疗[3]。棘阿米巴性角膜炎的发病机制类似于前两者, 此法是否可以应用于棘阿米巴性角膜炎的治疗, 国内外尚无确切的结论。本研究旨在评价离子导入角膜胶原交联法对兔眼棘阿米巴性角膜炎的治疗效果, 从而为临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法
1.1 材料

1.1.1 实验动物 选取经裂隙灯显微镜检查无眼前节病变的健康家兔40只[潍坊医学院动物饲养中心提供, 生产批号：SCXL（鲁）20120005], 10周龄, 体质量2.0~2.5 kg, 单笼饲养。生活环境维持在21~25 ℃, 采光遵循正常昼夜交替。实验动物的使用和喂养按照潍坊医学院实验动物伦理委员会（AEEC）的指导方针进行, 本研究方案得到AEEC批准。

1.1.2 主要试剂、棘阿米巴悬液及仪器 LED紫外线发射仪（Mod. VEGA 10 mW, 意大利SCO Srl公司）; 激光活体共聚焦显微镜（HRTII-RCM, 德国海德堡公司）。0.1%核黄素促渗剂溶液（RICROLIN® +, 意大利SOOFT公司）; 离子导入仪（Iontofor-CXL® , 意大利SOOFT公司）; 原虫虫株：A.polyphaga（由北京眼科研究所提供）; 灭活的大肠杆菌混悬液（潍坊医学院病原生物教研室提供）。

1.2 方法

1.2.1 棘阿米巴纯化培养 根据刘家英等[4]报道的方法进行棘阿米巴原虫培养。无菌操作箱中, 用1 ml无菌注射器吸取0.1 ml灭活的大肠杆菌混悬液, 均匀涂布于NNA平板上, 将棘阿米巴原虫接种于NNA中心, 用胶布密封培养皿避免水分蒸发, 置于28 ℃恒温箱中培养, 每日用显微镜观察棘阿米巴包囊及滋养体形态。待4~6 d棘阿米巴原虫由滋养体转化为包囊后, 于远离接种中心的包囊集落处, 用无菌针头挑起琼脂小块, 正面朝下覆盖在另一个涂有灭活大肠杆菌平皿中央处, 再次继续培养。

1.2.2 收集滋养体 同法转换接种4次后, 取部分包囊转入PYG液体培养基, 等其大部分转为滋养体并呈对数增长时, 将培养瓶置于4 ℃冰箱中放置5 min。待绝大部分滋养体脱离瓶壁后收集至离心管予以离心, 离心率为1 000 rpm。给予PBS洗涤3次后, 在血细胞计数板上调整棘阿米巴原虫浓度为1× 106/ml（90%以上的滋养体）, 应用台盼蓝染色检测滋养体活力, 结果显示其活力> 90％。

1.2.3 建立兔棘阿米巴性角膜炎模型 造模均由同一有经验的医师操作。实验前称体重, 速眠新II 0.1~0.2 ml/kg肌注致兔全身麻醉。以右眼为实验眼, 左眼为空白对照。用圆刀片刮除实验眼的全部角膜上皮, 将0.1 ml棘阿米巴悬液自角膜旁中央处注入兔眼角膜基质层间（同一位置、同一深度）, 造成直径约3.0 mm乳白色水肿区, 然后配戴软性角膜接触镜[5], 造模过程见图1。

图1. 棘阿米巴性角膜炎造模过程
A：刮除实验眼的全部角膜上皮; B：将0.1 ml棘阿米巴悬液注入角膜基质层间造成直径约3 mm乳白色水肿区; C、D：配戴角膜接触镜Figure 1. Surgical induction of acanthamoeba keratitis.
A: The entire corneal epithelium of the experimental eye was removed by scraping; B: Acanthamoeba suspension (0.1 ml) was injected into the corneal stroma, causing about a 3 mm diameter milky white, edema region; C, D: Applying the corneal contact lens.

1.2.4 实验眼棘阿米巴病原体鉴定 造模48 h后对实验眼的角膜病灶处行角膜溃疡区刮片涂片菌检, 涂片后在显微镜下观察, 如看到稳定状态的包囊（见图2A）及复制各期的滋养体（见图2B）, 即实验眼角膜刮片结果为阳性。刮片阴性者行角膜共聚焦显微镜检查, 由浅入深扫描病灶区角膜, 观察有无棘阿米巴串珠状结构（见图2C）。角膜刮片或共聚焦显微镜检查阳性均为造模成功。本研究40只实验眼均查及棘阿米巴包囊或滋养体。

图2. 棘阿米巴原虫鉴定图片
A：角膜刮片细胞学镜检可见稳定期的包囊（如箭头所示）, × 100; B：复制各期的滋养体（如箭头所示）, × 100; C：共聚焦显微镜检查可见大量串珠状结构提示棘阿米巴包囊的存在（如箭头所示）, × 800Figure 2. Images of the acanthamoeba protozoa.
A: Stability of the cysts (arrow) as seen by cytological examination of corneal scrapings, × 100. B: Confocal microscopy image showing replication of a trophozoites (arrow), × 100. C: Images of many bead-like structures suggest the presence of acanthamoeba (arrow), × 800.

1.2.5 实验分组 采用随机数字表法将造模成功的家兔平均分为4组：模型组（A）, 药物治疗组（B） （以下简称药物组）, 核黄素-紫外线角膜胶原交联组（C） （以下简称交联组）, 药物联合交联组（D） （以下简称联合组）。造模48 h后, 药物组和联合组给予药物治疗：予以配置的0.02%洗必泰滴眼液联合2%甲硝唑滴眼液点眼, 每日各7次。交联组和联合组兔实验眼在造模48 h后马上行离子导入角膜胶原交联法治疗：在无菌条件下, 清除眼表分泌物, 负压吸引罩杯于角膜, 连接电极线, 将0.1%促渗剂核黄素滴加于罩杯内, 接通电源后离子导入5 min, 观察核黄素进入前房后, 予以370 nm紫外线照射, 设定功率10 mW/cm2, 光圈直径9 mm, 共照射9 min, 总能量为5.4 J。

1.2.6 实验眼角膜病变程度分级 治疗后每日用裂隙灯显微镜观察病情变化, 参考McNeill的方法[6]对角膜病变程度进行分级。0级：角膜透明、无水肿; 1级：角膜轻度水肿, 虹膜纹理清晰可见; 2级：角膜水肿、混浊, 但仍可窥见虹膜纹理; 3级：角膜明显混浊可见到瞳孔缘, 可有少量散在的漂浮状脓液; 4级：角膜严重混浊, 前房结构无法窥见, 可有前房积脓及角膜层间积脓。通过对4个实验组角膜病变程度进行分级, 来评估治疗效果。

1.2.7 实验眼角膜共聚焦显微镜观察 共聚焦显微镜的放大倍率为800倍, 可以直观地显示棘阿米巴包囊及滋养体的存在。因此治疗90 d后, 通过共聚焦显微镜观察不同深度棘阿米巴原虫的密度可以直接地反映不同实验组的治疗效果。

1.2.8 实验眼角膜组织病理学观察 治疗90 d后于兔耳缘静脉注入空气5 ml处死家兔。剪取实验眼的角膜组织, 分别置于体积分数4%甲醛溶液中, 进行固定、修剪标本、脱水、透明、浸蜡、染色、封片等步骤后, 于显微镜下行角膜组织病理学观察。

1.3 统计学方法

实验研究。采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析。采用完全随机分组单因素多水平实验设计, 4个组间不同角膜病变分级眼数分布的差异比较采用Kruskal-Wallis H检验, 组间两两比较采用Nemenyi检验; 共聚焦显微镜和病理结果中棘阿米巴原虫的密度比较均采用2× 2的析因设计, 对各实验因素的主效应及因素间的交互效应进行析因设计方差分析。组间两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 角膜病变程度分级

造模48 h后眼部均可见大量脓性分泌物, 球结膜重度充血水肿, 角膜基质层呈乳白色混浊、水肿, 无法窥见虹膜及瞳孔。治疗前由同一观察员采用双盲法按角膜病变程度进行分级。其中3只兔眼为3级, 37只兔眼为4级, 各组间角膜病变分级的差异无统计学意义（χ 2=1.054, P=0.788）。

治疗90 d后, 裂隙灯显微镜检查示：4组角膜病变不同分级的眼数不同（χ 2=19.738, P < 0.001）, 见图3、表1。联合组角膜病变分级明显低于模型组（Z=-3.755, P < 0.001）、药物组（Z=-2.068, P=0.039）和交联组（Z=-2.690, P=0.007）, 差异均具有统计学意义, 药物组与模型组（Z=-3.199, P= 0.001）, 交联组与模型组（Z=-2.179, P=0.029）两两比较差异均有统计学意义, 药物组与交联组两两比较差异无统计学意义（Z=-1.31, P=0.189）。

图3. 治疗90 d后4组棘阿米巴性角膜炎兔裂隙灯显微镜情况
A：模型组全角膜基质重度混浊, 完全无法窥见眼内情况; B：药物组角膜基质混浊, 可透见瞳孔缘; C：交联组角膜基质混浊, 基本无法窥见前房情况; D：联合组角膜基质轻度混浊, 可透见虹膜纹理Figure 3. Slit lamp photography findings after 90 days of treatment in four groups acanthamoeba keratitis rabbits.
A: In the untreated model group (Group A), the entire corneal stroma was severely turbid, completely preventing clear observation of the anterior chamber and pupil. B: In the drug-treated group (Group B), the corneal stroma was also turbid, penetrating to the level of the pupil margin. C: In the crosslinked group (Group C), the corneal stroma was also turbid, obscuring the anterior chamber. D: In the joint treatment group that received both drug treatment and crosslinking (Group D), the corneal stroma was mildly cloudy, and the texture of the iris was visible.

表1 治疗90 d后4组棘阿米巴性角膜炎兔角膜病变严重程度分级 Table 1 Severity of corneal lesions in the four groups acanthamoeba keratitis rabbits after 90 days of treatment
2.2 共聚焦显微镜检查

治疗90 d后, 4组的兔实验眼均行角膜共聚焦显微镜检查, 见图4, 扫描的角膜深度分别为100、200、300 μ m。使用Image J图像处理软件对棘阿米巴包囊密度进行测定, 结果示：3个深度药物组、交联组、联合组棘阿米巴原虫密度值均低于模型组, 差异具有统计学意义（均P < 0.05）, 药物组与交联组在治疗上存在交互作用, 这种交互作用表现为协同作用。4组棘阿米巴原虫的密度值见表2。

图4. 治疗90 d后4组棘阿米巴性角膜炎兔共聚焦显微镜下情况
A：模型组大量棘阿米巴包囊样结构及炎症细胞; B：药物组棘阿米巴包囊样结构及炎症细胞明显少于模型组; C：交联组也见大量棘阿米巴包囊样结构及炎症细胞; D：联合组棘阿米巴包囊样结构基本消失, 且炎症细胞明显少于药物组及交联组。× 800Figure 4. Confocal microscopy findings after 90 days of treatment in four groups acanthamoeba keratitis rabbits.
A: In the model group (Group A), there were mang encapsulated structures containing acanthamoeba and stromal inflammatory cells. B: In the drug-treated (0.02% chlorhexidine eye drops combined with 2% metronidazole eye drops) group (Group B), there were significantly fewer encapsulated acanthamoeba structures and inflammatory cells than in the model group. C:The crosslinked group (Group C) also had many encapsulated acanthamoeba structures and inflammatory cells. D:The group treated with both drug and crosslinking (Group D) had significantly fewer encapsulated structures of acanthamoeba and the inflammatory cells than did either the drug-treated group or the crosslinked group. × 800.

表2 共聚焦显微镜下4组不同深度棘阿米巴原虫的密度 Table 2 Density (visual field) of Amoeba protozoa in four groups acanthamoeba keratitis rabbits under confocal microscopy
2.3 实验眼角膜病理切片结果

由同一有经验的医师对所有兔实验眼行角膜病理切片HE染色。观察所有染色图片, 每张图随机选取5处1 mm× 1 mm大小的范围, 显微镜下计数棘阿米巴包囊和滋养体总数量, 得出棘阿米巴原虫的密度。结果示：模型组棘阿米巴原虫的密度为24.9 ± 1.1、药物组为20.6 ± 0.5、交联组为22.3 ± 0.8、联合组为14.5 ± 0.7。药物组（F=55.055, P < 0.001）、交联组（F=29.607, P < 0.001）、联合组（F=4.420, P=0.043）棘阿米巴原虫密度值均低于模型组, 差异具有统计学意义, 药物组与交联组在治疗上存在交互作用, 这种交互作用表现为协同作用。根据基质层的稀疏程度来判断胶原纤维的破坏程度, 显微镜下观察角膜基质胶原纤维破坏程度：交联组明显轻于药物组、交联组、联合组。见图5。

图5. 治疗90 d后4组棘阿米巴性角膜炎兔角膜病理切片结果
A：模型组角膜基质破坏严重, 可见大量坏死物质、炎症细胞及阿米巴原虫（× 100）; B、C：药物组和交联组均见大量阿米巴原虫, 但较模型组略少; D：联合组仅见少量炎症细胞（× 200）Figure 5. Histophathological findings after 90 days of treatment in four groups acanthamoeba keratitis rabbits under confocal microscopy.
A: The corneal stroma of the untreated model group (Group A) was severely damaged, accompanied by abundant necrotic material, inflammatory cells, and acanthamoeba (× 100). B, C: The drug-treated group (Group B) and the crosslinked group (Group C) each had many acanthamoeba, but slightly less than the model group. D: The combined treatment group (Group D) had only a small number of inflammatory cells (× 200).

3 讨论

研究表明, AK的发生机制为棘阿米巴原虫与角膜上皮结合从而引发角膜上皮大片脱落, 同时棘阿米巴能够分泌多种蛋白酶导致宿主基质层的胶原纤维组织破坏并产生剧烈的炎症反应[7]。目前, AK主要采取局部药物治疗, 但由于没有针对性的药物, 所以治疗效果差, 病程长[8]。此外, 临床上通常采用频繁点眼的方法来维持靶组织的药物高浓度, 但夜间点眼次数减少容易引起阿米巴包囊转化为滋养体, 且药物的毒副作用均会加重角膜的熔解从而导致溃疡迁延不愈。

角膜胶原交联（Corneal collegan cross-linking, CXL）是利用370 nm波长的紫外线A照射感光剂核黄素, 使核黄素激发为三线态并产生活性氧族, 后者进一步与各种分子相互作用, 从而诱导胶原纤维的氨基之间发生化学交联反应[9, 10]。研究表明[3], 交联过的角膜不但机械强度增加, 抗酶解能力亦增强。大量的研究表明, CXL对细菌性角膜炎及真菌性角膜炎的治疗均取得了良好效果[11, 12]; 而AK的发病机制与前两者类似, 因此, CXL对棘阿米巴性角膜炎可能也有一定的治疗效果。

Sorkhabi等[13]选取10例严重的感染性角膜炎患者（致病菌包括细菌、真菌和棘阿米巴）行CXL联合药物治疗均获得满意效果。Khan等[14]报道3例棘阿米巴性角膜炎患者经CXL联合药物治疗后主观症状明显改善。Papaioannou等[15]报道了11例棘阿米巴性角膜炎患者行CXL联合药物治疗后, 其中10例患者治愈。以上研究均显示CXL治疗棘阿米巴性角膜炎有效, 与本研究的结果一致。但以上研究仅通过患者的主观症状及溃疡灶的愈合情况来说明治疗效果, 且缺乏对照组。本研究的不同之处在于：①设置了对照组, 消除无关量变对实验结果的影响; ②对兔眼角膜病变进行细化分级, 更利于判断病灶的愈合程度; ③增加共聚焦显微镜和病理组织切片检查, 可直接观察组织的超微结构及棘阿米巴密度的变化。

Berra等[15]报道单纯采用CXL治疗兔眼棘阿米巴性角膜炎未见明显效果。其选择的是传统CXL模式, 即能量密度为3 mW/cm2, 照射时间为30 min。本实验选择的能量密度为10 mW/cm2, 照射9 min, 为高能量短时间照射, 结果显示单纯CXL、药物联合CXL对棘阿米巴性角膜炎治疗均有效。2个实验结果不同的原因可能与选择的能量密度及照射时间不同有关。根据Bunsen-Roscoe定律[16], 只要保持照射的总能量不变, 通过增加单位面积的照射能量来缩短照射时间的方法, 可达到甚至超越治疗标准的治疗效果。研究表明核黄素在交联过程中会消耗氧气, 且随着交联时间的延长氧耗量会随之增大。而快速CXL法在保证总照射能量的前提下大大缩短照射时间从而减少氧耗量[17]。在氧充足的条件下经紫外线A照射10~15 s即可发生化学反应, 使交联的发生更加深入, 因此较传统CXL更有效。

离子导入角膜胶原交联法治疗兔眼棘阿米巴性角膜炎有效, 且药物联合交联的效果明显优于单纯药物疗法及单纯交联法。本研究对于棘阿米巴性角膜炎的治疗提供了新的参考依据, 有望用于指导临床治疗。但本实验的缺点在于选择的例数较少, 且能否多次行交联治疗以及交联对角膜内皮的安全性也有待进一步观察。

利益冲突申明 本研究无任何利益冲突

作者贡献声明 张亚丽：收集数据, 参与选题、设计及资料的分析和解释; 撰写论文; 根据编辑部的修改意见进行修改。刘丽梅：参与选题、设计和修改论文的结果、结论。刘玉强：参与选题、设计及资料的分析和解释。张少斌：参与选题、设计、资料的分析和解释, 修改论文中关键性结果、结论, 根据编辑部的修改意见进行核修。明春秀：收集数据、实验操作; 根据编辑部的意见进行修改。刘丽峰：收集数据、实验操作; 根据编辑部的意见进行修改

The authors have declared that no competing interests exist.

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