引用本文
徐剑, 周亚莎, 彭俊, 潘坤, 李建超, 覃艮艳, 彭清华. RCS（rdy-/-,p-/-）大鼠虚中夹瘀证实验评价[J]. 中华眼视光学与视觉科学杂志, 2018,20(9): 519-524.
Jian Xu, Yasha Zhou, Jun Peng, Kun Pan, Jianchao Li, Genyan Qin, Qinghua Peng. The Experimental Evaluation of the RCS (rdy-/-, p-/-) Rat with Blood Stasis and Deficiency Syndromes[J]. CHINESE JOURNAL OF OPTOMETRY OPHTHALMOLOGY AND VISUAL SCIENCE, 2018,20(9): 519-524.  
Doi: 10.3760/cma.j.issn.1674-845X.2018.09.002
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RCS（rdy-/-,p-/-）大鼠虚中夹瘀证实验评价
徐剑, 周亚莎, 彭俊, 潘坤, 李建超, 覃艮艳, 彭清华
410007 长沙,湖南中医药大学第一附属医院眼科
通信作者：彭清华（ORCID：0000-0002-9378-1330）,Email：pqh410007@126.com

第一作者：徐剑（ORCID：0000-0002-2451-2401）,Email：jg_mao@sina.com

收稿日期: 2018-03-22
基金资助: 湖南省教育厅创新平台开放基金项目（16K065）;湖南中医药大学中医诊断学国家重点学科开放基金优先资助项目（2015ZYZD02）;中医药防治五官科疾病湖南省重点实验室建设项目（2017TP1018）;长沙市科技计划项目（kc1704005）;中央财政支持地方高校建设项目
摘要

目的 论证视网膜色素变性经典动物模型RCS（rdy-/-,p-/-）大鼠具有的“虚中夹瘀”的病理机制。方法 实验研究。将10只RCS（rdy+/+,p+/+）大鼠（雌雄各5只）设为空白组;RCS（rdy-/-,p-/-）大鼠共10只（雌雄各5只）设为模型组。观察2组大鼠的一般形态学及行为学特征,评价2组大鼠的生物学差异。ELISA法测定其虚证和瘀证指标,虚证指标包括视网膜匀浆组织中cAMP、cGMP含量和cAMP/cGMP值以及血浆中前列腺素（PG）、雌二醇（E2）含量;瘀证指标为血浆中P-selectin含量、血液流变学指标检测。组织切片HE染色观察2组大鼠视网膜结构。对2组数据行独立样本 t检验。结果 模型组大鼠明显消瘦、神疲乏力、反应迟钝、行动缓慢、被毛蓬起无光泽、易受惊吓、食量小、大便略松软,其中雌性大鼠血浆中E2含量值明显低于空白组的雌性大鼠,差异有统计学意义（ t=2.67, P=0.03）;雄性大鼠血浆中PG含量值低于空白组的雄性大鼠,差异有统计学意义（ t=4.12, P=0.003）。空白组大鼠视网膜组织匀浆cAMP、cGMP、cAMP/cGMP均高于模型组,差异有统计学意义（ t=18.87、12.63、11.76, P < 0.001）。当血流切变力分别为5/s、100/s、200/s时,模型组大鼠血黏度值高于空白组,差异有统计学意义（ t=5.58、4.40、6.80, P < 0.001）。模型组大鼠血浆黏度值、全血高切相对指数、全血低切相对指数、纤维蛋白原均高于空白组,差异有统计学意义（ t=5.20,8.25,9.08,6.15, P < 0.001）。模型组大鼠血浆中P-selectin含量明显高于空白组,差异有统计学意义（ t=4.30, P=0.003）。模型组大鼠视网膜各层结构明显较空白组紊乱,视网膜厚度萎缩变薄,病变主要位于视网膜外层及视锥与视杆细胞。结论 视网膜色素变性经典模型RCS（rdy-/-,p-/-）大鼠具有形体消瘦,肾精亏虚且虚中加瘀等病理生理特点。

关键词: 视网膜色素变性; RCS大鼠; 虚证; 瘀证
The Experimental Evaluation of the RCS (rdy-/-, p-/-) Rat with Blood Stasis and Deficiency Syndromes
Jian Xu, Yasha Zhou, Jun Peng, Kun Pan, Jianchao Li, Genyan Qin, Qinghua Peng
Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital of Hunan University of Traditional Chinese Medicine, Changsha 410007, China
Corresponding author:Qinghua Peng, Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital of Hunan University of Traditional Chinese Medicine, Changsha 410007, China (Email: pqh410007@126.com)
Fund:Open Fund Project of Innovation Platform of Hunan Provincial Education Department (16K065);Hunan University of Chinese Medicine National Key Discipline Open Fund of Chinese Medicine Diagnoses Priority Project (2015ZYZD02);Hunan Provincial Key Laboratory for the Prevention and Treatment of Ophthalmology and Otolaryngology Diseases with Traditional Chinese Medicine (2017TP1018);Changsha Science and Technology Plan Project (kc1704005);Central Government Supports Local Universities' Construction Project
Abstract

Objective: To demonstrate that the RCS (rdy-/-, p-/-) rat model for retinitis pigmentosa has a blood stasis and deficiency pathogenesis.Methods: This was an experimental study. Ten RCS (rdy+/+, p+/+) rats were in the control group (5 males and 5 females); 10 RCS (rdy-/-, p-/-) rats were in the model group (5 males and 5 females). The general morphological and behavioral characteristics of the two groups of rats were observed to evaluate the biological differences between them. ELISA was used to determine the indicators of blood stasis and deficiency. The indicators of deficiency included cAMP, cGMP and cAMP/cGMP levels in retinal homogenate tissue, and plasma PG and E2 levels. The indicators of blood stasis were the P-selectin level in plasma, and hemorheology indexes. Tissue sections with HE staining were used to observe the retinal structures of the rats in the two groups. Independent sample t tests were performed on both sets of data.Results: The rats in the model group manifested significant weight loss, fatigue, unresponsiveness, slow movements, volumized and dull back hair, vulnerability to fright, low food intake, and slightly loose stools. The plasma E2 content in female rats was significantly lower than that in the control group, and the difference was statistically significant ( t=2.67, P=0.03). The plasma PG content in the male rats of the model group was lower than that of the control male rats, and the difference was statistically significant ( t=4.12, P=0.003). The levels of cAMP, cGMP, and cAMP/cGMP in retinal tissue homogenates of the control group were higher than levels in the model group, and the difference was statistically significant ( t=18.87, 12.63, 11.76, P < 0.001). When the blood flow shear forces were 5/s, 100/s, and 200/s, the blood viscosity of the model group was higher than that of the control group, and the difference was statistically significant ( t=5.58, 4.40, 6.80, P < 0.001). The plasma viscosity value, whole blood high incision relative index, whole blood low incision relative index, and fibrinogen in the model group were higher than those in the control group, and the difference was statistically significant ( t=5.20, 8.25, 9.08, 6.15, P < 0.001). The content of P-selectin in the plasma of the model group was significantly higher than that of the control group ( t=4.30, P=0.003). The retinal thickness of rats in the model group was significantly thinner than that of the control group, and the structure of each layer of the rat's retina in the model group was disordered and atrophic. The lesions were mainly located in the outer layer of the retina, and the cones and rods were atrophic.Conclusions: The RCS (rdy-/-, p-/-) rat model of retinitis pigmentosa has pathophysiological characteristics such as body weight loss, deficiency of kidney essence, and blood stasis deficiency.

Keyword: retinitis pigmentosa; Royal college of surgeons rats; deficiency; blood stasis

视网膜色素变性（Retinitis pigmentosa, RP）是以进行性光感受细胞及视网膜色素上皮功能丧失为共同表现的遗传性视网膜变性疾病[1], 主要临床特征表现为夜盲、进行性视野损害、眼底色素沉着和视网膜电图异常或者无波形等[2, 3, 4]。

RP属中医高风雀目内障范畴, 中医认为RP病理机制为以虚为主, 所以古今医家在治疗RP时, 多从虚着手。大量的临床病例观察和机理研究结果显示, 该病虽以虚为本, 但以实瘀为标, 在其病理过程中自始至终贯穿着血瘀病理[5, 6, 7, 8]。证实多数RP患者为本虚夹瘀之证, 临床多见虚中夹瘀证, 可分为阴虚夹瘀和阳虚夹瘀。目前, 中医针对这一证型的治疗尚停留在临床研究及个案报道层面, 动物研究也未深入到病证结合模型阶段, 缺乏中医病理机制方面的动物实验数据支撑。

RP经典动物模型皇家外科学院大鼠（Royal college of surgeons rat, RCS） （rdy-/-, p-/-）的遗传方式属于常染色体隐性遗传, 与人类RP有许多相似之处[9]。本研究尝试选择RP经典动物模型RCS（rdy-/-, p-/-）大鼠为研究对象, 探讨及论证RCS（rdy-/-, p-/-）大鼠的虚中夹瘀病机。为该病的中西医治疗及进一步深入研究提供理论支持。

1 对象与方法
1.1 实验动物

选择RCS（-/-, p-/-）大鼠10只为模型组, 雌雄各5只, 体质量140~160 g, 鼠龄28~42 d。RCS（rdy+/+, p+/+）大鼠10只为空白组, 雌雄各5只, 体质量200~220 g, 鼠龄28~42 d。2组鼠龄匹配[购自苏州昭衍新药研究中心有限公司, 动物生产许可证号：SCXK（苏）2013-0003]。饲养于湖南中医药大学动物实验中心SPF房, 室温（22± 2）℃, 湿度50%~55%, 定期更换垫料, 自由饮食。动物的饲养与处理经湖南中医药大学动物伦理委员会审批通过, 并遵循眼科及视觉科学研究协会关于眼科和视觉研究中对动物的处理原则。

1.2 试剂与仪器

4%多聚甲醛、Harris苏木素、伊红、3%过氧乙酸均购自北京中杉金桥生物技术公司, 无水乙醇、苯巴比妥钠、PBS液均购自长沙博士德生物试剂公司, E2-ELISA试剂盒、前列腺素（Prostaglandin, PG）-ELISA试剂盒、CD42P-ELISA试剂盒、cAMP-ELISA试剂盒、cGMP-ELISA试剂盒均购自武汉华美生物工程有限公司。

轮转石蜡切片机（RM2235）购自德国徕卡公司; 台式高速冷冻离心机（TGL-16）购自湖南湘仪离心机仪器有限公司; 全自动酶标洗板机（PW-812）、酶标仪（MB-530）购自深圳市汇松科技发展有限公司; 数码医学图像分析系统（Motic 6.0）购自深圳市沅恒科技有限公司, 摇床（TS-92）购自江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司; 恒温振荡器（THZ-C）购自江苏太仓市强乐实验设备有限公司; 台式冷冻离心机（TGL-18R）购自Eppendorf公司; 荧光定量PCR仪（PikoREAL 96）、荧光PCR板（SPL0960）购自美国麻省Thermo公司; 恒温水浴箱（HH-S2）购自河南金博公司; 旋涡混合器（QL-901）购自江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司, 荣事达普通冰箱（BCD-245F）购自合肥荣事达三洋有限公司; -80 ℃冰箱（DW-HL388）购自合肥中科美菱公司; 电磁炉（MC-EP186）购自广东美的生活电器制造有限公司; 精密PH计（雷磁E-201-C）购自上海仪电科学仪器有限公司; 电子天平（FA-N）购自上海民桥精密科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 一般生物学特征观察 观察2组RCS大鼠的一般形态学及行为学特征, 包括体格、反应、皮毛、进食以及大便情况, 评价2组RCS大鼠的生物学差异。

1.3.2 血液流变学的测定 2组RCS大鼠（20只）, 1%苯巴比妥钠3.5 ml/kg腹腔注射麻醉, 麻醉成功后, 分离腹主动脉, 使用绿色盖头肝素抗凝管采血, 采血量约3 ml, 采血时上下摇动采血管, 使血液充分接触采血管壁。采血结束后立即送血样行血液流变学检测。血液流变学检测指标：不同切变力下血黏度、血浆黏度、全血高切相对指数、全血低切相对指数、红细胞集聚指数、纤维蛋白原。

1.3.3 血浆中E2、PG含量的测定 2组RCS大鼠（20只）成功采血3 ml后继续用绿色盖头肝素抗凝管采集腹主动脉血, 采血后30 min内, 1 000 r/min低温离心15 min, 取上清液, 样本分装, -80 ℃冻存。检测时样品室温自然解冻, 采用ELISA法测定血浆中雌二醇（Estradiol, E2）、前列腺素（Prostagiandin, PG）的含量, 具体操作步骤根据试剂盒要求进行, 根据标准品的浓度和测得的吸光值绘制标准品曲线, 再进一步计算出E2、PG的浓度。

1.3.4 血浆中血小板P-选择素（P-selectin）含量的测定 将-80 ℃冻存的上述制备的2组RCS大鼠（20只）的血浆标本自然化冻, 采用ELISA法测定血浆中P-selectin的含量, 操作及方法按试剂盒说明书进行, 根据标准品曲线计算样品中的P-selectin含量。

1.3.5 cAMP、cGMP含量的测定 2组RCS大鼠（20只）经上述麻醉成功并采血后, 75%酒精消毒双眼眼睑周围, 眼科弯组织剪直接分离球周组织, 剪断视神经后摘除眼球。随机将每只RCS大鼠中的一个眼球置于冰浴的1× PBS溶液中, 并洗除眼球周围血液。清洗后, 眼球放在位于冰块上的广口玻璃皿中。在解剖显微镜下, 用眼科显微剪沿角巩膜缘剪开, 去除眼前节, 小心拭除玻璃体, 用显微镊子剥离出视网膜组织。1× PBS溶液洗净视网膜周围血污, 视网膜称重, 眼科显微弯剪剪碎视网膜, 加入1× PBS溶液置于玻璃匀浆器匀浆, 配制成10%的匀浆液, 置于低温5 000 r/min离心5 min, 取上清液, 将视网膜匀浆样品分装, 置于-80 ℃冰箱冻存。检测时室温自然解冻, 采用ELISA法测定视网膜匀浆中cAMP及cGMP的含量, 操作及方法按试剂盒说明书进行。根据标准品的浓度和测得的吸光度值绘制标准品曲线, 再进一步计算出cAMP、cGMP的浓度。

1.3.6 视网膜组织形态检查 将上述方法摘除的RCS大鼠另一个眼球立即放入4%多聚甲醛中固定, 参考文献[10]进行标本脱水、石腊包埋、切片、脱蜡, 然后进行HE染色。双目光学显微镜下观察2组RCS大鼠的视网膜各层结构。

1.4 统计学方法

实验对照研究。采用SPSS 23.0统计学软件进行数据分析。数据以$\bar{x}\pm s$表示。2组比较, 如满足正态及方差齐性则采用独立样本t检验, 不满足则采用秩和检验; 多组比较, 满足正态及方差齐性则采用方差分析, 不满足则采用秩和检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 一般生物学特征

空白组大鼠体格健壮、反应敏捷、行动迅速, 背毛紧密有光泽、食量正常、大便正常; 模型组大鼠明显消瘦、神疲乏力、反应迟钝、行动缓慢、背毛蓬起无光泽、易受惊吓、食量小、大便略松软。

2.2 血浆中E2、PG含量

模型组雌性大鼠血浆中E2含量低于空白组, 差异有统计学意义（t=2.67, P=0.03）。模型组雄性大鼠血浆中PG含量低于空白组, 差异有统计学意义（t=4.12, P=0.003）。见表1。

表1 2组RCS大鼠血浆E2、PG、P-selectin、视网膜匀浆cAMP、cGMP、cAMP/cGMP及血液流变学指标 Table 1 The plasma E2, PG and P-selectin levels, cAMP, cGMP and cAMP/cGMP levels in retinal homogenate tissue, and hemorheology indexes of 2 groups of RCS rats
2.3 视网膜组织匀浆中cAMP、cGMP含量

模型组视网膜匀浆组织中cAMP、cGMP含量高于空白组, 差异有统计学意义（t=18.87、12.63, P < 0.001）; 且cAMP/cGMP值高于空白组, 差异有统计学意义（t=11.76, P < 0.001）。见表1。

2.4 不同切变力下血黏度

当血流切变力为1/s, 50/s时, 空白组和模型组血黏度值差异无统计学意义。当血流切变力为5/s、100/s、200/s, 2组血黏度值差异有统计学意义为（t=5.58、4.40、6.80, P < 0.001）。见表1。

2.5 血液流变学指标

模型组血浆黏度值、全血高切相对指数、全血低切相对指数、纤维蛋白原高于空白组, 差异有统计学意义（t=5.20、8.25、9.08、6.15, P < 0.001）。模型组红细胞集聚指数高于空白组, 但差异无统计学意义（t=0.25, P=0.80）。见表1。

2.6 血浆中P-selectin含量

模型组血浆中P-selectin含量高于空白组, 差异有统计学意义（t=4.30, P=0.003）。见表1。

2.7 视网膜组织HE染色结果

RCS大鼠视网膜组织HE染色可见, 模型组大鼠视网膜全层厚度明显较空白组变薄, 模型组大鼠视网膜各层结构紊乱, 视网膜外层萎缩变薄明显, 尤其视锥、视杆细胞层萎缩变薄。空白组大鼠视网膜视锥、视杆细胞染色清晰可见。大部分模型组大鼠视网膜色素上皮条带丧失, 视网膜色素上皮条带的连续性受到破坏。部分外核层光感受器感觉纤毛层完全萎缩消失, 光感受器细胞核数目减少, 形态不规则, 小部分区域核染色集聚成团, 大部分区域未见外层光感受器细胞核染色。视网膜内层组织可见少量点状黑色素颗粒。见图1。

图1. 大鼠视网膜组织切片（HE, × 400）
A：空白组; B：模型组。红色箭头所示为视锥、视杆细胞层。绿色箭头所示为视网膜色素上皮条带Figure 1. Rat retina tissues biopsy (HE, × 400).
A, model group; B, control group. The cone and rod cell layer is indicated by the red arrow. Retinal pigment epithelial strip is indicated by the green arrow.

3 讨论

RCS（rdy-/-, p-/-）大鼠是第一个用于RP的病因及治疗方法研究的动物模型, 也是目前较成熟的研究RP发生、发展或治疗性研究的经典动物模型, 其遗传方式属于常染色体隐性遗传。由于RCS大鼠Mertk基因突变, 导致视网膜色素上皮细胞功能下降, 丧失对光感受器细胞外节脱落的膜盘的吞噬能力, 从而导致RP病变的发生[11, 12]。

在中医理论上, 视网膜色素变性名为“ 高风雀目” 。清代《杂病源流犀烛· 目病源流》谓本病“ 亦有生成如此, 并由父母遗体, ……不必治, 治亦无效。” 这就明确指出该病与遗传有关, 很难治。古今广大医家对本病病机的认识虽不尽相同, 但对本病乃由于“ 虚损” （或阴虚或阳虚或气虚或血虚等）致目失濡养而成的认识是一致的。中国传统医学认为, “ 肾为先天之本” , 肾在人体生长、发育和衰老的过程中起着至关重要的作用。先天是指人受胎时的胎元, 现代医学已经证实RP属于先天遗传性疾病, 故作为先天之本的肾在RP发生时势必受到累及。肾居下焦, 为阴中之阴脏, 具有封藏、贮存精气的作用。《素问· 阴阳应象大论》曰：“ 肾生骨髓, 髓生肝” 。发生RP时, 由于肾受累, 导致肾中所藏的肾精亏虚, 而精不足不能养肝, 故夜盲。现代研究认为性激素水平变化可作为判断肾虚客观指标[13, 14], 故本研究选取了大鼠血浆中E2及PG的含量作为评价肾虚证的生化指标。结果表明, 模型组大鼠血浆中E2及PG含量较空白组明显下降, 2组间差异有统计学意义, 提示模型组大鼠具有肾虚证病理生理特点。

现代研究认为cAMP类似中医的阳, 而cGMP类似中医的阴, cAMP和cGMP所引起的作用是相反的。cAMP促进脂肪分解、糖原分解、心肌收缩、溶酶体酶和组织胺减少, cGMP的作用则相反[15]。目前研究表明, 阴虚证患者的交感神经-β 受体-cAMP系统的功能偏亢进, 血中第2信使cAMP活性亦升高。例如阴虚火旺的甲亢患者, 其血浆中的cAMP和cGMP含量均明显升高[16]。故本研究选取了视网膜组织匀浆中cAMP及cGMP的含量作为评价阴阳虚证的生化指标。结果表明, 模型组大鼠视网膜匀浆中cAMP及cGMP及cAMP/cGMP比值均较空白组升高明显, 2组间差异有统计学意义, 提示模型组大鼠具有阴阳两虚的病理生理特点, 但以阴虚为主要证候。

既往大量的临床观察发现RP虽以虚为本, 但以实瘀为标, 在其病理过程中自始至终贯穿着血瘀病理。血瘀是指体内有血液停滞, 包括积存于体内的离经之血, 或血运不畅, 阻滞于经脉及脏腑内之瘀血, 血瘀证本质的微循环障碍及血液流变性异常已从大量临床与实验中得到证明。血液黏度是血液流变学的基本指标, 亦成为血瘀证指标, 其临床意义如下：低切变力下黏度高意味血流在流动慢时黏稠, 高切变力下黏度高意味血流在流动快时黏稠。本研究模型组大鼠在血流切变力为5/s、100/s、200/s时, 血黏度值明显高于空白组, 且2组间差异有统计学意义。说明模型组大鼠在低、高切变力下的血黏度值均增高, 证实模型组大鼠具有血瘀病理生理特点。模型组的血浆黏度值、全血高切相对指数、全血低切相对指数和纤维蛋白原均明显高于空白组, 且2组间差异有统计学意义。这提示模型组大鼠具有血瘀的病理生理过程。

P-selectin又名CD62p, 是目前所知最能反映血小板活化的特异性指标。P-selectin在正常机体含量较少。当受到炎症等外界损害后以及细胞过度凋亡等因素诱发会发生超敏炎症反应, 血清P-selectin选择性地黏附在细胞膜上, 并大量聚集, 介导内皮细胞和白细胞聚集黏附以及血栓形成。目前有研究发现, P-selectin的基因呈多形性改变[17, 18], 血小板和巨噬细胞的a颗粒、内皮细胞的Weibel Palade小体上可见跨膜P-selectin表达, 与中性粒细胞、单核细胞上的抗原结合, 促进了白细胞在内皮上黏附、滚动、聚集及活化并释放炎症过程。还有研究报道, P-selectin的表达与内皮细胞损伤因素对比, 血小板活化程度与P-selectin血浆浓度有关, 可以作为“ 金标准” 来表达血小板活化的状态[19, 20, 21]。血小板活化后可以释放血小板激活因子、PG等多种炎性介质, 进一步引起微血管变化, 如血管平滑肌收缩, 血管内炎性细胞聚集和微血栓的形成, 从而加重血瘀。本研究中模型组大鼠血浆中P-selectin含量高于空白组, 且差异有统计学意义, 证实模型组大鼠血小板功能亢进活化加重其血瘀证。

综上所述, RP经典动物模型RCS（rdy-/-, p-/-）大鼠虽以虚为本, 但以实瘀为标, 在其病理过程中自始至终贯穿着血瘀病理, RCS（rdy-/-, p-/-）大鼠具备了肾阴虚证, 且合并虚中夹瘀等病机。提示临床治疗RP患者可采用滋阴活血、温阳活血等方法, 在针灸、按摩时亦需要加强疏通经脉、活血化瘀。本研究亦为进一步开展活血化瘀法治疗虚中夹瘀证的PR模型鼠实验研究提供了基础理论支持。

利益冲突申明 本研究无任何利益冲突

作者贡献声明 徐剑：收集数据, 参与选题、设计及资料的分析和解释; 撰写论文; 根据编辑部的修改意见进行修改。周亚莎、彭俊、潘坤、李建超、覃艮艳：参与选题、设计和修改论文的结果结论。彭清华：参与选题、设计、资料的分析和解释, 修改论文中关键性结果、结论, 根据编辑部的修改意见进行核修

The authors have declared that no competing interests exist.

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