引用本文
曹兴伟, 李群英, 米珍, 秦伟, 谢学军. 丹皮酚磺酸钠对免疫性结膜炎的治疗作用及机制[J]. 中华眼视光学与视觉科学杂志, 2018,20(9): 525-529.
Xingwei Cao, Qunying Li, Zhen Mi, Wei Qin, Xuejun Xie. The Therapeutic Effect and Mechanism of Sodium Paeonolsilate on Immunologic Conjunctivitis[J]. CHINESE JOURNAL OF OPTOMETRY OPHTHALMOLOGY AND VISUAL SCIENCE, 2018,20(9): 525-529.  
Doi: 10.3760/cma.j.issn.1674-845X.2018.09.003
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丹皮酚磺酸钠对免疫性结膜炎的治疗作用及机制
曹兴伟, 李群英, 米珍, 秦伟, 谢学军
646000 泸州,西南医科大学附属中医医院眼科（曹兴伟、李群英）
100072 北京丰台长辛店医院眼科（米珍）
528400 中山市中医医院眼科（秦伟）
610075 成都中医药大学（谢学军）
通信作者：谢学军（ORCID：0000-0002-0234-3141）,Email：1319394190@qq.com

第一作者：曹兴伟（ORCID：0000-0002-1635-0158）,Email：153448190@qq.com

收稿日期: 2017-02-06
摘要

目的 探讨丹皮酚磺酸钠对小鼠实验性免疫性结膜炎的治疗作用及机制。方法 实验研究。采用随机数字表法将36只（72眼）Balb/c小鼠平均分为正常对照组（A组）、模型组（B组）、1%丹皮酚磺酸钠组（C组）、2%丹皮酚磺酸钠组（D组）、色甘酸钠滴眼液对照组（E组）、奥洛他定滴眼液对照组（F组）,每组6只。以鸡卵白蛋白（OVA）腹腔注射免疫B、C、D、E、F组建立免疫性结膜炎动物模型;7 d后,A组和B组予磷酸缓冲盐溶液（PBS）滴眼,C、D组分别予1%、2%丹皮酚磺酸钠滴眼治疗,E、F组分别予色甘酸钠、奥洛他定滴眼液治疗。用药5 d,最后1次用药后进行眼部临床症状评分。以甲苯胺蓝染色观察检测结膜组织切片肥大细胞脱颗粒（MCD）情况,酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测各组小鼠血清的卵蛋白特异性免疫球蛋白E（OVA-s IgE）、干扰素γ（IFN-γ）及白介素4（IL-4）水平。所得数据组间比较采用单因素方差分析。结果 各组间症状评分差异具有统计学意义（ F=38.72, P<0.001）,其中B组症状评分明显高于A组（ P<0.001）,C、D、E、F组的症状评分均低于B组（均 P<0.05）。各组间肥大细胞计数差异具有统计学意义（ F=15.28, P<0.001）,B组及各用药组肥大细胞脱颗粒计数均明显高于A组（均 P<0.05）。C、D、E、F组小鼠血清中OVA-s IgE水平明显低于B组（ P<0.05）;A、C、D、E、F组小鼠血清中IFN-γ水平均明显高于B组（ P<0.05）,IL-4水平均明显低于B组（ P<0.05）。结论 丹皮酚磺酸钠对实验性免疫性结膜炎具有治疗作用,能够稳定实验性免疫性结膜炎小鼠眼结膜组织中肥大细胞,抑制活化脱颗粒,下调小鼠血清中OVA-sIgE、IL-4水平及上调IFN-γ水平。

关键词: 丹皮酚磺酸钠; 免疫性结膜炎; 肥大细胞; 特异性免疫球蛋白E; 干扰素γ; 白介素4; 小鼠
The Therapeutic Effect and Mechanism of Sodium Paeonolsilate on Immunologic Conjunctivitis
Xingwei Cao1, Qunying Li1, Zhen Mi2, Wei Qin3, Xuejun Xie4
1 Department of Ophthalmology, Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Southwest Medical University, Luzhou 646000,China
2 Department of Ophthalmology, Beijing Fengtai Changxindian Hospital, Beijing 100072, China
3 Department of Ophthalmology, Zhongshan Hospital of Traditional Chinese Medicine, Zhongshan 528400, China
4 Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610075,China
Corresponding author:Xuejun Xie, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610075, China (Email: 153448190@qq.com)
Abstract

Objective: To investigate the therapeutic effect of sodium paeonolsilate on experimental immunologic conjunctivitis in mice and to explore the mechanism of action.Methods: This was an experimental study. The Balb/c mice which immunologic conjunctivitis was initiated by intraperitoneal injection with ovalbumin (OVA) were randomly assigned to five treatment groups (Groups B-F, n=6 mice each), and another 6 mice served as uninjected controls (Group A). Both eyes of each mouse were treated with eyedrops 7 days after as follows: Group A, uninjected controls treated with phosphate-buffered saline (PBS); Group B, model group treated with PBS; Group C, treated with 1% sodium paeonolsilate group; Group D, treated with 2% sodium paeonolsilate group; Group E, treated with sodium cromoglicate; Group F, treated with olopatadine. After five days of medication or control treatments, ocular clinical symptoms were evaluated, and blood and conjunctival tissue were taken for analysis. Conjunctival tissue sections were stained with toluidine blue to visualize mast cell degranulation (MCD). Ovalbumin specific immunoglobulin E (OVA-s IgE), interferon-γ (IFN-γ), and interleukin-4 (IL-4) levels were determined in serum by enzyme linked immunosorbent assay. One-way analysis of variance was used for the comparison of data among the groups.Results: Symptom scores were significant among all groups ( F=38.72, P<0.001). The symptom scores in Group B, were significantly higher than those in Group A ( P<0.001). The symptom scores in each medication group were lower than those in Group B ( P<0.05). There were significant differences in the mast cell among the six groups ( F=15.28, P<0.001). The number of mast cell higher in Groups B-F than in the group A (all P<0.01). The serum levels of OVA-s IgE were significantly lower in Groups C-F than in the Group B (all P<0.05). The serum IFN-γ levels were significantly higher in Group A and Groups C-F than in Group B (all P<0.05). The serum IL-4 levels were significantly lower in Group A and Groups C-F than in Group B (all P<0.05).Conclusions: In mice, sodium paeonolsilate eye drops have a therapeutic effect on experimental immunologic conjunctivitis initiated by OVA injection.It stabilizes mast cells and inhibits activated degranulation. Sodium paeonolsilate down regulated serum levels of OVA-s IgE and IL-4 while upregulating IFN-γ.

Keyword: sodium paeonolsilate; immunologic conjunctivitis; mast cells; ovalbumin specific immunoglobulin E; interleukin-4; interferon-γ; mice

免疫性结膜炎（Immunologic conjunctivitis）以前又称变态反应性结膜炎, 是一类常见的变态反应性眼表疾病, 是结膜对外界过敏原的一种超敏免疫反应[1]。近年来, 属于中医学“ 目痒” 范畴, 《证治准绳》称其为“ 时复症” 。丹皮酚磺酸钠是丹皮酚的衍生物, 丹皮酚为中药牡丹皮的主要活性成分, 而牡丹皮是传统的中医药材, 具有祛瘀止血、抗菌消炎、镇静解痉、退热止痛等药理作用。现代药理研究表明丹皮酚药理活性广泛, 具有镇静、镇痛、催眠、解热、抗炎、抗过敏、免疫调节等功能[2]。免疫药理研究资料已证实丹皮酚可提高全身性细胞免疫和体液免疫功能[3]; 且能影响机体细胞免疫功能, 增加T细胞在血液循环中的比例, 刺激T细胞分泌淋巴因子[4]; 可抑制过敏反应, 影响T细胞对抗原的应答与效应2个阶段[5]。经磺化后得到的丹皮酚磺酸钠溶液, 大大增强了药物的水溶性, 可获得更好疗效[6]。为进一步探讨丹皮酚磺酸钠溶液对过敏反应的治疗效果, 本研究采用丹皮酚磺酸钠滴眼液治疗小鼠实验性免疫性结膜炎, 并探讨其治疗作用机制。

1 材料与方法
1.1 实验动物

选取经裂隙灯显微镜检查无眼病的健康Balb/C小鼠48只（华西动物实验中心提供）, 清洁级, 雌性, 8周龄, 体质量（22± 2）g, 每6只1笼, 室温维持在20~25 ℃, 采光遵循正常昼夜交替。实验动物喂养按照成都中医药大学实验动物伦理委员会的指导方针。本研究得到成都中医药大学实验动物伦理委员会批准。

1.2 药物、试剂及仪器

色甘酸钠滴眼液（郑州卓峰制药厂）, 奥洛他定滴眼液（美国爱尔康眼药厂比利时分厂）, 丹皮酚磺酸钠注射液（南京金陵制药厂）, 1%和2%丹皮酚磺酸钠滴眼液（用PBS将丹皮酚磺酸钠注射液分别稀释为1%和2%）。

鸡卵白蛋白（Ovalbumin, OVA; 美国sigma公司）, PBS（北京中杉金桥生物技术有限公司）, 卵蛋白特异性免疫球蛋白E（Ovalbumin specific immunoglobulin E, OVA-s IgE）试剂盒（美国RD公司）, 干扰素γ （Interferon-γ , IFN-γ ）试剂盒（美国RD公司）, 白介素（Interleukin-4, IL-4）试剂盒（美国RD公司）, Herzeus varifuge 3.0RS型离心机（美国Kendro公司）, 酶标仪（美国Bio-Rad公司）。

1.3 分组及用药

1.3.1 实验分组 采用随机数字表法将48只（96眼）Balb/c小鼠平均分为正常对照组（A组）、模型组（B组）、1%丹皮酚磺酸钠组（C组）、2%丹皮酚磺酸钠组（D组）、色甘酸钠滴眼液对照组（E组）、奥洛他定滴眼液对照组（F组）, 每组各8只。

1.3.2 免疫性结膜炎动物模型的建立方法[7]以及实验用药方法 ①致敏阶段：致敏当天将含有致敏原OVA 100 μ g的PBS缓冲液与AL（OH）35 mg共200 μ l的混合物, 经腹腔注射使B、C、D、E、F组小鼠致敏。A组不做任何处理。②免疫干预阶段：在腹腔注射致敏原后第7天, 分别给予B、C、D、E、F组PBS、1%丹皮酚磺酸钠滴眼液、2%丹皮酚磺酸钠滴眼液、色甘酸钠滴眼液、奥洛他定滴眼液滴入小鼠双眼治疗, 每天3次, 连续药物干预5 d。③激发阶段：在药物免疫干预治疗后将OVA（浓度5 mg/ml）溶于pH7.2的PBS中, 用微量加样器滴入B、C、D、E、F组小鼠的双眼进行致敏原攻击以诱发免疫性结膜炎的临床症状, 每日1次, 连续1周后进行眼部症状观察评分, 评判造模是否成功。④治疗阶段：每组按照局部评分, 剔除评分较低的2只, 每组剩余6只进行后续的治疗。OVA激发诱导免疫性结膜炎成功后, 分别给予B、C、D、E、F组PBS、1%及2%丹皮酚磺酸钠滴眼液、色甘酸钠滴眼液、奥洛他定滴眼液滴入小鼠双眼治疗, 每天3次, 连续治疗5 d。

1.4 评分方法

最后一次治疗结束后, 在裂隙灯显微镜下观察免疫性结膜炎的急性超敏反应, 采取盲法分别对结膜充血、眼睑浮肿、分泌物产生等3个指标进行评分[7]：结膜充血（睑结膜和球结膜）：0分, 正常; 1分, 结膜呈粉红色; 2分, 结膜呈红色; 3分, 结膜呈暗红色, 有瘀点、瘀斑。眼睑浮肿：0分, 无; 1分, 仅下眼睑水肿; 2分, 上下睑均水肿, 眼睑部分闭合; 3分, 眼睑外翻, 水肿明显, 眼睑至少半闭合; 4分, 上下睑及睑缘均水肿。分泌物产生：0分, 无; 1分, 稀黏液状; 2分, 眼睑及周围的毛发潮湿; 3分, 眼睑及周围的毛发潮湿, 稠黏液状。最后将3种指标各自的分值相加得出总分, 得分范围为0~10分。

1.5 组织形态学观察

评分结束30 min后处死所有小鼠。为了保留完整的结膜, 小鼠眼球摘除时连同眼睑一起摘除, 置入10%中性甲醛固定至少24 h, 经乙醇梯度脱水, 二甲苯透明浸蜡后, 用石蜡包埋成块, 4 μ m连续切片。采用甲苯胺蓝染色, 在显微镜下对小鼠结膜切片进行观察, 计数其中的肥大细胞、脱颗粒肥大细胞与肥大细胞总数之比。肥大细胞计数以随机选取3个高倍镜下肥大细胞总数计算均值, 脱颗粒肥大细胞率由脱颗粒肥大细胞数/肥大细胞总数× 100%表示。

1.6 血清OVA-s IgE、IL-4、IFN-γ 含量的检测

取小鼠腹主动脉血, 离心留取血清-20 ℃保存。用ELISA方法检测血清中的OVA-s IgE、IFN-γ 及IL-4含量。首先按ELISA说明书行标准品稀释, 分别设置空白孔及待测样品孔, 将待测品按样品血清稀释5倍, 加入待测样品孔中50 μ l; 用封板膜封板后置37 ℃温育30 min; 小心揭掉封板膜, 弃去液体, 甩干, 每孔加满稀释20倍的洗涤液, 静置30 min后弃去, 反复5次; 加入酶标试剂50 μ l, 用封板膜封板后置37 ℃温育30 min, 重复操作4次; 加入显色剂, 轻轻震荡混匀, 37 ℃避光显色15 min; 加入终止液50 μ l; 15 min后, 450 nm波长依顺序测量吸光度（OD值）。

1.7 统计学方法

实验研究。采用SPSS 19.0软件进行统计学处理。数据如符合正态分布, 各组间比较采用单因素方差分析, 如不符合正态分布, 组间数据比较采用秩和检验。以P< 0.0 5为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 各组间小鼠眼局部炎症症状评分比较

各组间小鼠眼局部刺激症状评分总体差异有统计学意义（F=38.72, P< 0.001）, 其中B组显著高于A组, 差异有统计学意义（P< 0.001）; 各用药组低于B组, 差异有统计学意义（P< 0.05）; C组与D组间评分差异无统计学意义（P=0.50）。见表1。

表1 各组小鼠眼局部刺激症状评分、结膜切片肥大细胞计数及脱颗粒肥大细胞率比较 Table 1 Comparison of local irritation symptoms in mice, mast cell count and percentage of mast cell degranulation in mouse conjunctiva section
2.2 各组小鼠结膜切片肥大细胞计数及脱颗粒肥大细胞率情况

各组间肥大细胞计数总体差异有统计学意义（F=15.28, P< 0.001）, 其中B组肥大细胞计数显著高于A组, 差异具有统计学意义（P< 0.001）。 A组及C、D、E、F组脱颗粒肥大细胞率明显低于B组, 差异有统计学意义（P< 0.05）, C组与D组比较, 差异无统计学意义（P=0.13）。见表1。

2.3 各组小鼠血清中OVA-s IgE、IL-4、IFN-γ 含量比较

B组小鼠血清中OVA-s IgE水平显著高于A组, 差异具有统计学意义（P< 0.001）, C组、D组及F组小鼠血清中OVA-s IgE水平均明显低于B组, 差异具有统计学意义（P< 0.05）, C组与D组之间差异无统计学意义（P=0.659）。

B组小鼠血清中IFN-γ 含量水平明显低于A组, 差异具有统计学意义（P< 0.001）, C、D、E、F组血清中IFN-γ 含量水平均明显高于B组, 差异具有统计学意义（P< 0.05）, 且D组血清中IFN-γ 含量水平高于C组, 差异具有统计学意义（P=0.035）。

B组小鼠血清中IL-4含量明显高于A组, 差异具有统计学意义（P< 0.001）, C、D、E、F组血清中IL-4含量水平均明显低于B组, 差异具有统计学意义（P< 0.05）。见表2。

表2 各组小鼠血清中IL-4、IFN-γ 、OVA-s IgE含量水平比较 Table 2 Comparison of IL-4, IFN-γ and OVA-s IgE in the serum of mice in each group
3 讨论

免疫性结膜炎是最常见的一种眼表疾病之一, 近年来, 由于自然环境变化、配戴角膜接触镜等因素影响, 免疫性结膜炎的发病率有明显增高的趋势, 世界人口中约5%以上患者因免疫性结膜炎到眼科就诊, 已成为影响患者生活质量的重要疾病之一[8]。其发病机制早期反应主要由肥大细胞和T细胞参与介导, 机体与变应原接触后, 抗原与特异性免疫球蛋白E（Immunoglobulin E, IgE）结合, 引起肥大细胞脱颗粒, 释放炎症介质（如组胺、类胰蛋白酶、前列腺素、白三烯等）[9]。另一方面, 纤维细胞和晚期反应激活的肥大细胞释放的细胞因子白介素作为第二信使, 促使变态反应进入晚期反应, 作用于结膜, 募集炎性细胞, 包括嗜酸性、嗜碱性、中性粒细胞以及辅助性T淋巴细胞2（T helper cells, TH2）, 引起免疫炎症反应的第二次高峰。T细胞亚群（+） （Cluster of differentiation 4+, CD4+）TH细胞是结膜炎症时期最主要的细胞。CD4（+）TH细胞可分为TH0、TH1、TH2等3种亚群。TH0是天然T细胞, 受刺激后可转变为TH1或TH2细胞[10]。IFN-γ 和IL-4分别是TH1细胞与TH2细胞分泌的主要细胞因子。IL-4可使B细胞的抗体应答从IgM向IgE转换[11], 使IgE合成增加, 并增强B细胞表面Fcε R Ⅱ 的表达。而IFN-γ 能抑制TH2细胞的增殖和IL-4的功能。在机体正常情况下TH1和TH2处于动态平衡状态。抑制TH1向TH2转化或增强TH2向TH1转化是控制Ⅰ 型变态反应的根本原则[12]。

因此免疫性结膜炎涉及多种因素相互作用, 临床上难以根治, 以局部对症药物治疗为主, 严重病例考虑全身及联合用药, 强调在早期抑制肥大细胞脱颗粒和炎性介质的释放。但大多数治疗只是缓解却不能消除免疫反应引起的症状, 并且药效持续时间短, 治疗停止后病情易复发, 且不良反应大。根据该病的发病机制, 寻找一种抗菌消炎、抑制型变态反应, 调节机体免疫功能作用的多靶点的治疗药物, 是目前研制治疗免疫性结膜炎新药的主要方向。因此中成药眼用制剂治疗免疫性结膜炎受到了越来越广泛的重视。

中医药在治疗免疫性结膜炎方面具有丰富的经验, 虽然在中医古代医籍中没有免疫性结膜炎的明确记载, 在当代的中医眼科教材中也没有对应的病名。但免疫性结膜炎均有一个共同的、突出的自觉症状— — 目痒。因此, 免疫性结膜炎可以归属于中医眼科“ 目痒[12]” 之范畴。在古代有“ 痒极难忍” 、“ 痒若虫行” 之记载。如《秘传眼科龙木论眼痒极难忍外障》谓：“ 此眼初患之时, 忽然痒极难忍, 此乃肝脏有风, 胆家壅热冲上所使” 。《银海精微》云：“ 痒极难忍者, 肝经受热, 胆因虚热, 风邪攻充, 肝含热极, 肝受风之燥动, 木摇风动, 其痒发焉” 。《审视瑶函》亦云：“ 痒有因风、因火、因血虚而痒者。” 由此可见, 对于以目痒为主要症状的眼病, 中医多责之于风、热。因风为春季之侯, 故目痒常于春季加重, 治疗多从祛风清热论治。牡丹皮具有清热凉血、活血散瘀之功效, 虽然目前单独应用牡丹皮治疗免疫性结膜炎的文献鲜见报道, 但是牡丹皮是中医眼科临床治疗免疫性结膜炎时常选用的药物。丹皮酚为牡丹皮的主要活性成分, 丹皮酚磺酸钠为丹皮酚的磺化物, 其分子式为C9H9NaO6S, 为白色或类白色结晶性粉末, 在水中易溶, 在甲醇或乙醇中微溶, 在氯仿、醋酸乙酯或丙酮中几乎不溶。因此本研究选用丹皮酚磺酸钠配置滴眼液进行免疫性结膜炎的实验治疗研究。

本研究选用目前治疗免疫性结膜炎最常用且效果较好的色甘酸钠和奥洛他定进行对比。色甘酸钠是使用最早、最广的第一代肥大细胞稳定剂, 对所有类型的免疫性结膜炎均有疗效, 该药通过抑制肥大细胞脱颗粒, 抑制组胺释放来治疗眼部过敏症状, 同时还能抑制其他炎性介质（如前列腺素、白三烯）释放。奥洛他定具有强效抗组胺和稳定肥大细胞膜的双效作用, 该药能选择性拮抗H1受体, 同时能抑制人多核细胞和嗜酸性粒细胞释放脂类炎性介质。故选择此2种阳性对照药来判断比较丹皮酚磺酸钠的治疗效果。

本研究初步得出丹皮酚磺酸钠对小鼠实验性免疫性结膜炎具有一定的治疗作用, 其作用机制主要是通过抑制免疫性结膜炎小鼠结膜肥大细胞活化脱颗粒, 抑制肥大细胞释放炎症介质, 下调血清中IL-4, 从而抑制B细胞的抗体应答从IgM向IgE转换, 使IgE合成降低。再通过上调血清中IFN-γ , 而抑制TH2细胞的增殖和IL-4的功能, 抑制机体内TH1向TH2转化, 使机体TH1和TH2处于动态平衡状态, 通过这一治疗机制达到控制Ⅰ 型变态反应, 治疗免疫性结膜炎的作用。本研究仅是丹皮酚磺酸钠对免疫性结膜炎的治疗作用及治疗机制的初步探索, 在观察指标的选择方面尚需进一步完善, 如增加对嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、抗组胺等方面的观察, 另外实验中每组小鼠的数量应进一步扩大, 还应涉及毒副作用的观察, 这些都有待进一步深入的研究。

利益冲突申明 本研究无任何利益冲突

作者贡献声明 曹兴伟 ：收集数据, 参与选题、设计及资料的分析和解释; 撰写论文; 根据编辑部的修改意见进行修改。李群英：参与修改论文的结果、结论。米珍、秦伟：参与实验。谢学军：参与选题、设计及资料的分析和解释; 根据编辑部的修改意见进行修改

The authors have declared that no competing interests exist.

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