TgAPPswePS1转基因小鼠, [B6C3-Tg(APPswe, PSEN1dE9) 85 Dbo/J]由Jackson Laboratory实验室(Bar Harbor, ME, USA)提供, 由南京模式动物研究所购买引进并进行繁殖。研究中的所有小鼠都都经过基因鉴定, 方法参考之前报道的文献^[9], AD阳性转基因小鼠基因为APPswe（+）与PSEN1dE9（+）, AD阴性转基因小鼠基因为APPswe（-）与PSEN1dE9（-）。选取约24月龄TgAPPswePS1阳性转基因小鼠为实验组, 年龄匹配的阴性转基因小鼠为对照组, 实验组和对照组各6只小鼠。

切片机Cm1850-1-1（德国Leica公司）, 蔡司体式显微镜（德国Zeiss公司）, 荧光显微镜（Axioylan2 imaging, 德国Zeiss公司）, 共聚焦显微镜（LSM510MEH, 德国Zeiss公司）, 罗兰电生理仪（德国RETIPORT公司）。Aβ 抗体（美国新泽西州Covance公司）, APP抗体（美国马萨诸塞州Chemicon公司）, DAB染色试剂盒（武汉Beyotime公司）、40 g • L^-1多聚甲醛（美国Sigma公司）, 抗体封闭液、抗体稀释液（武汉Boster公司）, 抗荧光淬灭封片剂H-1200（美国Vector Labs公司）, DAPI（美国Invitrogen公司）, 复方托吡卡胺滴眼液（沈阳兴齐制药公司）。

采用罗兰电生理仪（RETIPORT ERG recording system, 德国RETI Technologies公司）, ERG检查方法按照文献^[5]。在实验前, 所有的小鼠都暗适应至少8 h, 然后用复方托吡卡胺滴眼液散瞳后, 给予4.3%水合氯醛腹腔注射麻醉（按照0.01 ml/g）, 待小鼠麻醉后, 滴0.5%普鲁卡因表麻, 然后于角膜上放置角膜电极, 于尾巴上皮下插入接地电极, 舌下放置参考电极。在0.008 cd/m²s（-25 dB）白色闪光刺激下获得视杆细胞（Rod）反应, 2.5 cd/m²s（0 dB）白色闪光刺激下获取最大混合（Max）反应, 3 s内3次独立的刺激合成1个反应, 每只眼睛测量3次反应, 选择N作为刺激开始点, 分别测量a、b波的波幅、潜伏期等数据, 每组6只小鼠, 取平均值进行统计。

实验组和对照组小鼠采用10%水合氯醛（0.05 ml/g）腹腔注射麻醉后, 用预冷PBS经心脏灌注处死, 取眼球, 然后用4%PFA/PBS于常温下固定24 h, 转入0.025%NaN₃/PBS中保存, 置于4℃备用。

1.4.1 石蜡切片制备 常规漂洗后, 进行梯度乙醇脱水, 依次为:50%乙醇2 h; 70%乙醇2 h; 80%乙醇2 h; 90%乙醇2 h; 95%乙醇2 h; 100%乙醇2 h; 然后二甲苯× 2次, 共45 min; 在熔点为52~56℃的软蜡中浸泡15 min× 2次; 浸蜡的组织块放入包埋框中, 硬蜡（熔点为60~62℃）中包埋, 蜡块备用。切片机连续切片, 厚约4 μ m, 贴附于载玻片上。

1.4.2 免疫组织化学染色 常规石蜡切片脱腊至水, 步骤:二甲苯 10 min× 2→ 梯度乙醇（100％→ 100％→ 95％→ 95%→ 90%→ 80%→ 70％, 各2 min）; 双蒸水泡片5 min, 以保持最好细胞形态; 将切片置于蒸馏水新鲜配置的0.3﹪H₂O₂, 室温5~10 min以阻断内源性过氧化酶反应; 蒸馏水洗3次, 每次2 min; 微波修复抗原:将切片浸入0.01 mmol/L枸橼酸钠缓冲液（pH=6.0）, 煮至缓冲液沸腾, 间隔5~10 min后, 反复1~2次, 冷却后PBS洗涤1~2次; 将切片浸入10%~70%甲酸1~10 min后, PBS洗涤2~3次。封闭液封闭:滴加UBB, 室温30 min; 滴加一定比例稀释的一抗APP[22C11 Chemicon(Bellerica, MA), 1∶ 100], Aβ [6E10 Covance(Denver, PA), 1∶ 100], 4℃过夜; PBS冲洗, 10 min× 3次; 滴加试剂SABC, 20~37℃ 20 min; PBS洗5 min× 4次; DAB显色:使用DAB显色试剂盒。取1 ml蒸馏水, 加试剂盒中A、B、C试剂各1滴, 混匀后加至切片。室温显色, 镜下控制反应时间, 一般为5~30 min。蒸馏水洗涤; 苏木素轻度复染、脱水、透明、封片; 实验设阴性对照组, 以PBS代替特异性第一抗体, 其他步骤同上。

免疫组织化学和激光共聚焦显微镜采集图像都由1人独立完成, 在相同实验条件下采集不同组病理或免疫染色图像, 由专门人员进行统计。

APP和Aβ 切片免疫反应强度:每组取12个眼球, 选取距视乳头300~600 μ m处位置, 选择非连续切片视野, 在Image Pro Plus5软件中统计APP、Aβ 免疫反应强度。

视网膜厚度测量:选择各组约12个眼球, 每个眼球取经视乳头非连续性切片3张, 使用Photoshop 9中的ruler工具, 选择距视乳头300~600 μ m位置, 进行5~7个不同位置测量, 再取平均值, 最后计算各组视网膜厚度。

实验研究。采用SPSS 19.0软件进行统计学分析, 所有计量资料均以 ± s表达, 组间均数比较采用Student's t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

为了研究AD转基因小鼠视网膜功能变化, 本研究对实验组和对照组小鼠进行ERG电生理检查, 研究发现老龄的转基因小鼠电生理发生明显变化, 其中Rod与Max反应的具体波幅值见表1, 其典型波形见图1。

在对照组, 首先发现Rod 波形明显, 存在明确的a波和b波波形, 给以光刺激后从a波快速上升, 形成平台, 到达b波如图1A所示, 波幅值见表1。进一步进行Max反应检测, 研究发现Max反应存在明确的a波和b波波形, 给以光刺激后出现的第1个波谷为a波, 继而出现快速上升形成波峰, 最高的波峰为b波, 波形如图1B所示, 波幅值详见表1。

在实验组, ERG检测到Rod反应, 波形同对照组相一致（见图1C）, 实验组Rod反应a波波幅为（17.9± 4.8）μ v, 与对照组比较, 实验组小鼠的Rod反应的a波波幅发生改变, 波幅下降（见表1）, 进一步观察Rod反应b波, 波幅为（46.3± 5.4）μ v（见表1）, 同对照组比较, 发现b波波幅存在明显的下降, 2组间差异存在统计学意义（t=5.23, P=0.002）。

对于实验组的Max反应, 首先可以观察到实验组的Max反应波形（见图1D）, 可以观察到明确的a、b波, a波波幅为（27.3± 1.8）μ v, 而b波波幅为（107.5± 8.5）μ v, 同对照组比较, 实验组的Max反应中的a、b波的波幅都发生明显下降, 差异均存在统计学意义（t=15.69、15.76, P < 0.001）。

Rod与Max反应的a、b波潜伏期, 实验组与对照组间比较, 差异均无统计学意义, 说明视网膜电生理潜伏期没有受到损害。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 对照组与实验组小鼠视网膜电图波幅（μ v） Table 1 Amplitude (μ v) of electroretinography in control and experimental groups Groups Rod-a Rod-b Max-a Max-b Control 18.1 ± 5.3 88.9 ± 22.2 54.5 ± 6.4 194.2 ± 33.8 Experimental 17.9 ± 4.8 46.3 ± 5.4 27.3 ± 1.8 107.5 ± 8.5 t 0.27 5.23 15.69 15.76 P 0.293 0.0023 < 0.001 < 0.001 Values are means ± standard deviation.

表1 对照组与实验组小鼠视网膜电图波幅（μ v） Table 1 Amplitude (μ v) of electroretinography in control and experimental groups

图1.

Figure 1.

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图1. 实验组与对照组小鼠Rod与Max波形图 A:光刺激为-25 dB时, 对照组的Rod反应波形图; B:光刺激为0 dB时, 对照组的Max反应波形图; C:光刺激为-25 dB时, 实验组的Rod反应波形图, 同对照组比较, b波波幅明显下降; D:光刺激为0 dB时, 实验组的Max反应波形图, 同对照组比较, b波波幅明显下降; A、C垂直标尺为100 μ V, B、D垂直标尺为200 μ V, 水平每一个方格为20 ms。N指示刺激开始时的基线位置Figure 1. Rod and maximum response waves in the experimental and control groups. A: The rod response stimulated by a flash at -25 dB in the control group. B: The maximum ERG response stimulated by a flash at 0 dB in the control group. C: The rod response stimulated by a flash at -25 dB in the experimental group.The b wave amplitude decreased significantly compared to the control group. D: The maximum ERG response stimulated by a flash at 0 dB in the experimental group. The b wave amplitude is significantly less than in the control group. Vertical scale bar=100 μ V for A, C, and 200 μ V for B, D. Horizontal scale bar=20 ms. N, the baseline of the recording when light stimulation is presented. ERG, electroretinogram.

为了研究AD转基因小鼠视网膜结构改变, 对视网膜进行组织切片观察（见图2B、2D）, 研究发现实验组小鼠的视网膜各层结构无缺失, 无明显紊乱:神经纤维层和神经节细胞层结构完整清晰, 内外颗粒层排列规则、无明显紊乱, 细胞核结构清晰, 内外丛状层及外节未见明显异常缺失性改变, 同对照组比较, 结构相一致（见图2A、2B, 免疫组织化学切片结果）。通过测量从内界膜到外核层的距离, 发现对照组与实验组视网膜厚度分别为（173.2± 13.2）和(157.4± 11.2)μ m, 提示AD转基因小鼠视网膜厚度变薄, 但是2组间差异无统计学意义（t=1.85, P=0.087）。

图2.

Figure 2.

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图2. APP与Aβ 蛋白在视网膜上的免疫反应 A:对照组的APP免疫组织化学染色图, PBS代替一抗; B:APP在实验组视网膜内的阳性表达, 呈弥散聚集, 箭头所示; C:对照组视网膜切片Aβ 无阳性表达; D:实验组视网膜切片上Aβ 呈阳性免疫反应, 箭头示Aβ 蛋白弥散性表达, 短箭示Aβ 蛋白斑块样沉积。标尺:20μ m。NFL, 神经纤维层; INL, 内颗粒层; IPL, 内丛状层; ONL, 外颗粒层; OPL, 外丛状层; RPE, 色素上皮细胞; APP, 淀粉样前体蛋白; Aβ , 淀粉样蛋白Figure 2. The positive immunoreactivity of APP and Aβ in retinal sections. A: There is no APP immunohistochemical staining in the control group; the primary antibody is shown with phosphate-buffered saline (PBS) instead. B: The APP positive staining shows diffuse aggregation in the retinas of the experimental group, indicated by arrow. C: No Aβ expression is detected in retinal sections in the control group. D: The positive Aβ expression is detected in retinal sections in the experimental group, with a diffuse pattern indicated by the arrow head and Aβ plaque deposits indicated by the short arrow. Scale bar=20 μ m. NFL, nerve fiber layer; INL, inner granular layer; IPL, inner plexiform layer; ONL, outer granular layer; OPL, outer plexiform layer; RPE, pigment epithelium cell; APP, amyloid precursor protein; Aβ , amyloid beta.

我们利用APP特异性抗体检测小鼠视网膜中APP免疫反应, 研究发现, 在对照组里APP为非特异性的背景反应, 几乎呈阴性免疫反应（见图2A）; 而在转基因小鼠视网膜中存在APP免疫阳性反应, 切片上呈现棕黄色、强阳性反应（见图2B）, 分布方式以弥散性为主, 表达在视网膜全层中, 主要在神经纤维层（Nerve fiber layer, NFL）、神经节细胞层（Ganglion cell layer, GCL）胞浆、内丛状层（Inner plexiform layer, IPL）、内核层（Inner nuclear layer, INL）及外核层（Outer nuclear layer, ONL）中。

通过可以识别细胞内的Aβ 沉积与老年斑块中的Aβ 聚集的Aβ 特异性抗体来检测实验组视网膜中Aβ 表达。在对照组上, 如图2C所示, 视网膜切片上基本无Aβ 阳性表达, 仅背景免疫反应而已。在实验组视网膜切片上, 研究发现Aβ 存在阳性反应, 呈棕黄色强阳性, 观察Aβ 反应形态, 发现Aβ 沉积有弥散性分布（见图2D）和斑块沉积（见图2D） 2种形式。分析图2D箭头所示的Aβ 沉积, 进一步发现弥散性分布的Aβ 阳性反应在视网膜各个层中均可观察到, 累及GCL、IPL、INL、外丛状层（Outer plexiform layer, OPL）、ONL及外节（Outer segment, OS）层, 由于RPE层本身色素含量太多, 无法通过DAB染色显示是否存在Aβ 阳性表达; AD特征性病理结构就是细胞外的Aβ 斑块沉积, 如图2D短箭头所示, 在实验组视网膜上存在Aβ 斑块, 斑块沉积部位包括了神经上皮表层的NFL、GCL、IPL、INL、ONL及OS, 个别斑块甚至累及RPE及脉络膜。

本研究通过特异性的抗体, 在TgAPPswePS1小鼠视网膜切片内发现APP强阳性反应, 弥散性特征, 提示了转基因小鼠视网膜存在APP强表达, 说明转基因鼠视网膜存在淀粉样改变的基础条件; 在本研究中采用的TgAPPswePS1小鼠是最经典的AD模型鼠^{[10, 11, 12]}, 已经被证实大约在6~7月龄小鼠脑内可以找到Aβ 斑块沉积, 而在大约12月龄小鼠视网膜中可以找到Aβ 弥散性表达^{[5, 6]}, 我们应用Aβ 特异性抗体检测TgAPPswePS1小鼠视网膜, 也发现了APP代谢产物Aβ 的阳性反应, 不同于既往发现的Aβ 弥散性表达, 本研究进一步发现了Aβ 聚集并在视网膜上形成斑块沉积（如图2D短箭所示）, 且视网膜内Aβ 斑块沉积形态与在AD大脑内已经报道的斑块沉积形态基本一致, 这个斑块状特征性形态说明在AD转基因小鼠视网膜上存在AD相关的特征性病理改变; 从分布角度来看, Aβ 沉积几乎在全层视网膜结构都可以检测到, 包括RGC、IPL、INL、OPL、ONL等, 对于具体的Aβ 来源, 目前不甚清楚, 考虑到已经有研究^[13]报道了缺氧可以导致RGC发生淀粉样改变而加重RGC功能损伤, 换句话说, RGC可以自身合成分泌Aβ , 那么其他各层细胞是否也具有合成分泌Aβ 的功能?视网膜上各层的Aβ 沉积来源问题尚需进一步研究。

我们的研究还发现, 与对照组的视网膜厚度比较, AD转基因小鼠视网膜厚度虽有变薄但是无统计学意义, 这一结果与Perez等^[5]报道相一致, 说明AD转基因小鼠视网膜上虽有Aβ 沉积, 但是无视网膜结构变化; 众所周知Aβ 沉积可以对周围的神经元产生损伤作用, 尤其是给予外源性Aβ 蛋白可以导致视网膜神经节细胞死亡^{[14, 15]}, 将这些结果综合一起, 说明内源性的Aβ 沉积对视网膜的细胞毒性作用并非那么直接且更加复杂, 当然也不排除外源性的Aβ 对视网膜损伤是因为局部浓度过高原因所致。AD转基因小鼠的ERG检测结果存在波幅减弱, 提示视网膜功能存在损伤, 以往有研究发现Aβ 沉积可以影响递质传递而损伤视网膜功能^{[16, 17]}, 所以对本研究发现的视网膜功能改变和视网膜结构存在轻度变薄的结果, 推测可能原因为:沉积在视网膜上的Aβ 可能还未产生细胞毒性作用损伤视网膜结构, 却已经影响某些递质传递从而导致视网膜ERG功能改变^[17], 换句话说, Aβ 沉积可能在早期就通过影响视网膜递质传递而损伤视网膜功能, 所以功能损伤往往比结构损伤早, 这一推测尚需在AD模型鼠上进一步研究证实。

众所周知, 目前AD的诊断以临床诊断为主, 开展脑组织病理学检查是否有Aβ 斑块沉积来确诊AD十分不现实, 所以早期且无创地检测AD相关病理特征Aβ 或SP就成为研究者一直探索的热点^[18]。本研究观察老龄AD转基因小鼠, 在视网膜中发现Aβ 斑块沉积, 这一结果具有重要意义, 因为视网膜作为活体唯一可以直接观察的神经组织, 眼部同颅内存在一定的联系, 所以提示我们可以通过眼部直接观察AD相关的Aβ 斑块改变, 如果能再进一步明确眼部的AD相关改变与脑部的改变是否存在直接且同步的相关性, 那么通过眼部表现诊断AD就成为一个值得期待且可行的方法, 通过研究眼部AD改变指导脑部情况就存在现实理论基础, 届时视网膜就可以作为观测AD病理进展及治疗反应的窗口, 从而对AD的诊断治疗产生重大的影响。

本研究也存在明显不足, 如视网膜厚度测量非活体测量的数值, 导致结果与实际情况存在一定的偏差, 其次关于Aβ 分子水平的研究尚需要进一步探索。

综上所述, 本研究以老年的AD转基因小鼠视网膜病理变化为切入点, 发现Aβ 在视网膜沉积, 视网膜结构功能发生改变, 提示AD模型动物视网膜上存在典型AD病理特征表现, 为AD疾病相关的视功能障碍提供理论基础, 但具体相关的分子机制仍有待进一步研究。

利益冲突申明 本研究无任何利益冲突

作者贡献声明 董志章:实施研究, 收集数据, 参与选题、设计及资料的分析和解释; 统计分析; 撰写论文; 根据编辑部的修改意见进行修改。李娟:酝酿和实验设计; 分析解释数据; 参与选题; 统计分析。孙雪荣:分析和解释数据, 对文章的知识性内容进行核修。葛坚:参与选题、设计、资料的分析和解释, 统计分析; 修改论文中关键性结果结论, 根据编辑部的修改意见进行核修